胃癌转移相关转录因子筛选及SRF调控miR-199a促进胃癌转移的分子机制研究

摘要

胃癌转移是多基因参与，受多种信号转导蛋白和转录因子调控的一个复杂的过程，而转录因子的调控作用是转移过程中的关键问题，可能为胃癌转移研究提供新的预测指标和干预靶点。目前关于胃癌相关的转录因子主要包括AP-1,NF-κB,Sp1,EGR,CREB,ATFs等，这些转录因子并不能完全解释胃癌转移的分子机制，新的转录因子的发现及其具体调控通路的分子机制研究迫在眉睫。
　　既往的研究表明，SRF可能是一个潜在的促肿瘤转移分子，它可以在体外促进结肠癌、肺癌及乳腺癌细胞系发生转移；而其具体机制、通过哪些分子、通路发挥作用还不清楚。同时，SRF在胃癌转移中发挥什么作用、及其具体作用机制有待于进一步深入探讨。本课题将对以上这些问题进行研究。
　　【目的】
　　1、通过体内筛选探讨参与胃癌转移相关的转录因子；
　　2、探讨筛选出的转录因子SRF与胃癌发生侵袭、转移及粘附等的相关性；
　　3、找出SRF下游效应miRNA分子，探讨SRF促进胃癌细胞转移的可能机制的影响。
　　【方法】
　　1、采用转录因子活性谱芯片方法通过两次比较高、低转移潜能的胃癌转移细胞系得到与胃癌转移相关的转录因子并验证；
　　2、采用Westernblot、免疫组织细胞化学观察活性的SRF蛋白在胃癌有转移组织中的表达和细胞定位；
　　3、通过基因重组方法构建SRF的siRNA质粒、全长上调质粒(馈赠)和对照质粒；
　　4、采用体外细胞粘附实验、侵袭、迁移实验、体内裸鼠尾静脉注射肝脏转移实验等研究SRF对胃癌细胞GC9811、GC9811-P和SGC7901的粘附、侵袭、迁移和体内转移能力的影响；
　　5、通过realtimePCR检测胃癌转移组织及细胞系中转染SRFsiRNA质粒后的SRF、miR-199a-5p、miR-199a-3p表达水平变化；
　　6、采用染色质CHIP、启动子报告基因、双荧光素酶报告基因实验检测SRF与miR-199a基因是否存在直接的正向或者负向调控关系。同时通过体外实验验证miR-199a对肿瘤的转移能力的影响。
　　【结果】
　　1、通过体内转移模型筛选胃癌转移相关转录因子
　　我们采用高通量转录因子活性谱芯片，通过对体内筛选得到的低转移胃癌细胞系GC9811和高转移胃癌细胞系GC9811-P两种细胞系进行两次筛选，得到了20个可能与胃癌转移相关的转录因子。其中包括目前已报道与肿瘤转移密切相关的转录因子NF-κB，AP-1，ATFs，Sp1，CREB，EGR。经过ELISA验证，我们选择其中SRF为研究对象进行进一步探讨。
　　2、有活性的转录因子SRF在转移胃癌组织及细胞中表达升高
　　我们采用免疫组化技术检测了活化的SRF蛋白在25例胃的正常组织、25例没有肠化生的炎症组织、21例慢性胃炎伴肠化生组织、28例胃癌原发灶和26胃癌淋巴结转移灶、22例远端转移组织中的表达，结果发现与原发灶等组织相比，活化的SRF（p-SRF）主要定位于胃癌转移组织细胞的胞浆和胞核中，以胞核为主。采用WesternBlot方法检查6例胃癌的癌旁组织、原发灶和转移灶的胞浆蛋白和胞核蛋白表达，结果与免疫组化相同。同样，SRF在低转移胃癌细胞GC9811中主要为胞浆表达，而在高转移胃癌细胞GC9811-P细胞中主要为胞核表达。以上结果提示：SRF在胃癌组织细胞发生转移早期主要在胞浆中表达，经过磷酸化后活化的SRF从胞浆中转位进入细胞核，进而促进胃癌发生转移。
　　3、体内、外实验证实转录因子SRF可以促进胃癌细胞侵袭、转移。
　　我们进而构建了SRF的siRNA载体，同时也购买了SantaCruz的siRNA载体，稳定转染或者瞬时转染了胃癌高转移细胞系GC9811-P细胞和胃癌SGC7901细胞。结果发现SRFsiRNA转染后，GC9811-P细胞和SGC7901对细胞外基质Matrigel的粘附能力下降。敲除SRF也抑制了GC9811-P细胞和SGC7901细胞穿过带Matrigel胶或者没有铺胶的Millicell小室迁移能力及划痕实验中两细胞的迁移能力，进而证明SRF可以影响胃癌细胞的侵袭、迁移能力。体内裸鼠尾静脉注射迁移实验表明，SRFsiRNA能明显抑制GC9811-P及SGC7901细胞的肝脏、肺脏及腹膜转移能力。采用SRF全长质粒上调胃癌低转移细胞系GC9811及SGC7901细胞系后，两细胞系的侵袭、迁移、粘附能力显著增强。上述结果提示，胃癌细胞中的SRF是影响胃癌细胞侵袭、迁移、粘附和体内转移能力的重要分子。
　　4、转录因子SRF通过调控miR-199a分子的表达促胃癌细胞侵袭、转移。
　　先前有研究提示SRF在心肌细胞中可通过影响含有CArG元件的miRNAs分子的表达来发挥其调控作用。我们进一步用realtimePCR方法证实SRF能上调miR-199a-3p和miR-199a-5p的表达。同时实验中也发现，与对照组织相比，在SRF高表达的胃癌转移组织及细胞中，miR-199a-3p和miR-199a-5p也为高表达。SRFsiRNA转染敲除SRF的表达后，GC9811-P细胞中的miR-199a-3p和miR-199a-5p表达显著下调。同时发现在胃癌高转移GC9811-P细胞中的SRF在细胞核内可以直接结合miR-199a-1和miR-199a-2的启动子区域，进而正向启动miR-199a-1和miR-199a-2的转录，其成熟的miRNAs分子中miR-199a-5p可以促进胃癌转移，而miR-199a-3p没有显著作用。
　　【结论】
　　本研究经过胃癌体内转移模型筛选出与胃癌转移相关的转录因子，并发现其中有活性的转录因子SRF可以促进胃癌转移，同时这种转移作用通过进入到细胞核内的SRF直接结合并上调miR-199a分子的表达来实现。

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声明

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缩略语表

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英文摘要

前言

文献回顾

一、目前报道的与胃癌转移相关的转录因子

四、转录因子研究中有待解决的问题

正文

第一部分：胃癌转移相关转录因子的筛选及鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分：转录因子 SRF 在胃癌转移组织及细胞系中的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分:转录因子 SRF促进胃癌转移的功能研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分：转录因子 SRF 通过调控 miR-199a 促进胃癌转移

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢