125I放射性粒子近距离治疗前列腺癌的生物学基础研究

摘要

前列腺癌是威胁中老年人健康的重要杀手，发病率有明显的地域、种族区别。在欧美国家前列腺癌是中老年男性发病率最高的恶性肿瘤之一[1]。而在亚洲，尤其是我国和日本等东亚地区，前列腺癌的发病率不高。但是随着我国老龄化社会的到来，和针对前列腺癌检测手段的日益先进，尤其是血前列腺特异抗原(prostatespecificantigen,PSA)检查、直肠超声引导下前列腺穿刺活检的开展，我国的前列腺癌发生率大为提高，尤其是局限性前列腺癌，检出率日益增高[2]。根据国外前列腺癌治疗指南及我国制定的前列腺癌治疗指南的前列腺癌尤其是局限性前列腺癌的治疗方法，主要有根治性前列腺切除术、外放射治疗及近距离放射治疗等。
　　经直肠超声引导下经会阴穿刺粒子植入近距离治疗早期局限性前列腺癌，可以达到保留前列腺及其功能，减少并发症，最大限度的达到减瘤治疗而不对正常组织器官造成破坏的效果。早期采用该种治疗方式，优于前列腺根治术，虽仍有争议，但已成为国际泌尿外科学界及放疗界的共识。据美国放射肿瘤学会统计，因为近距离放射治疗疗效确切，明显降低并发症，优于根治切除手术，相比较2000年早期前列腺癌只有不到5％采用放射性粒子植入治疗，但2005年将上升到35％；同期的外科前列腺根治切除术将从35％降至5％[3]。但困扰国际泌尿外科学界和放疗学界的问题是：尽管该治疗有效且副作用较小，但该种治疗方式治疗前列腺癌的生物学作用，特性仍不是很明确。本实验旨在通过对放射性粒子照射后诱导前列腺癌细胞凋亡的研究及裸鼠动物实验以探讨放射性粒子杀伤前列腺癌的机制及其与剂量和剂量率的关系，为临床应用放射性粒子组织间近距离治疗肿瘤提供依据。
　　1、不同活度，低剂量率γ射线(放射性125I源)照射诱导前列腺PC3细胞凋亡的研究
　　目的：通过观察体外培养的前列腺癌PC3细胞在不同活度低剂量率γ射线(125I)照射下细胞凋亡的形态学变化及周期规律，探索不同放射性活度的低剂量率γ射线照射对肿瘤细胞凋亡的影响及其与剂量、放射性活度之间的关系，为更深入研究持续极低剂量率γ射线照射对肿瘤的杀伤机制奠定基础。
　　方法：体外培养的前列腺癌接收不同活度的放射性125I源照射（1）使用倒置显微镜进行观察
　　（2）通过流式细胞仪检测不同活度照射后的细胞凋亡率及细胞周期的变化。
　　（3）通过透射电镜观察照射后细胞的变化。
　　（4）克隆形成率试验观察细胞增殖能力的变化。
　　结果：
　　(1)流式细胞仪检测照射后细胞凋亡率
　　随照射活度和时间的增加，前列腺癌PC3细胞的凋亡率呈上升趋势。照射后7d组凋亡率最高，高于其他各时间点。剂量粒子活度剂量达到1.0mci时，凋亡率显著增加，且达实验最高峰值，凋亡指数（AI）为4.95％±1.52。
　　（2）透射电镜观察凋亡细胞形态
　　0.4mci、0.6mci、0.8mci及1.0mci实验组与空白对照相比较，观察48h细胞出现典型的凋亡表现，细胞体积变小，核膜皱缩，细胞核缩小，核内异染色质增多并凝结呈块团状，染色质边集，72h时这种变化仍然存在，并且较48h时更为典型。到168h时可观察到细胞核彻底碎裂，细胞形态消失，表明125I放射性粒子可以使前列腺癌PC3细胞凋亡。
　　(3)流式细胞仪检测细胞周期
　　随着粒子剂量的增加,G2/M期细胞所占比例增高,S期细胞逐渐减少，统计学分析，各组之间均有非常显著性差异(P<0.01)。
　　4)克隆分析观察细胞增殖能力的变化
　　随着粒子放射性活度增加，照射时间延长，细胞克隆形成率降低；随着粒子活度的增加，克隆形成率由55.11％降至最低3.86％。
　　结论：
　　（1）早期抑制肿瘤细胞的增殖，是肿瘤细胞衰老，出现凋亡，并形成高凋亡率可能是125I持续低剂量照射杀灭肿瘤的机制。
　　（2）125I粒子可以诱导体外培养的前列腺癌PC3细胞凋亡，可能是通过把细胞阻滞在G2/M期而导致细胞的凋亡。
　　（3）其诱导凋亡的能力放射性粒子诱导的肿瘤细胞凋亡是迟发型凋亡，从48h出现，范围在48h-168h之间，随着粒子活度的增加，出现凋亡的程度增加，凋亡率增加。
　　2、125I粒子组织间植入治疗裸鼠移植性前列腺癌的实验研究
　　目的：通过裸鼠成瘤后植入125I粒子，研究粒子植入治疗前列腺癌产生的生物学效应，明确125I粒子的杀瘤机制，并争取对临床应用125I粒子治疗前列腺癌提供依据。
　　方法：用统计学原则，随机将荷瘤裸鼠分成实验组和对照组（每组20只），空白对照组与实验组各自再分成5组(每组4只)。实验组植入剂量为0.4mci的放射性125I粒子，每天观察125I粒子植入后裸鼠一般情况及瘤体生长情况。并于植入后1d，3d，5d，7d，9d，按顺杀死相应的实验组与对照组中裸鼠，取出瘤体，标本用10％甲醛固定并用免疫组化方法检测Bax在肿瘤体内表达，以原位末端标记法(TIJNEL)法检测125I粒子诱导肿瘤细胞凋亡的程度。试验期间，每天观察肿瘤长径（a）、短径（b），计算出肿瘤体积（V=ab2/2），小鼠体重（W），处死后小鼠的瘤重（w），绘制肿瘤生长曲线，计算出群体倍增时间（T）和抑瘤率，并进行分析。
　　结果：
　　（1）125I粒子组织间植入治疗前列腺癌（PC3）实验组的抑瘤率较空白对照组高。
　　（2）Tunel染色示：对照组肿瘤细胞生长良好，少见细胞凋亡;实验组可见早中晚期凋亡细胞，可观察到细胞的凋亡形态随着放射时间的延长，凋亡细胞较对照组明显增多。
　　（3）粒子植入后第7d对照组免疫组化示：实验Bax表达均呈强阳性（＋＋＋），阳性细胞数分别为71.32±15..71％；空白对照组表达呈弱阳性（＋～＋＋），阳性细胞数分别为8.65±7.25％，两者比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:
　　1.本实验确证125I粒子对前列腺癌（PC3）移植瘤有明显的抑制作用
　　2.本实验确证125I粒子抑制了肿瘤细胞的增殖生长，诱导了肿瘤的凋亡。
　　3.125I粒子导致肿瘤细胞凋亡的机制可能与Bax蛋白相关。

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缩略语表

中文摘要

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前 言

文献回顾

1.前列腺癌

2 近距离放射(brachytherapy)治疗的基本概念

3、放射性核素治疗肿瘤的生物学机制。

4 放射性粒子近距离治疗肿瘤的发展历史

5 放射性粒子组织间近距离治疗特点

6 放射性粒子近距离治疗的适应证和禁忌证

7、放射性粒子近距离治疗的器械和操作方法

8、放射性粒子近距离治疗前列腺癌的标准方法 (美国近距治疗学会，American Branchytherapy Society, ABS)

9 放射性粒子近距离治疗前列腺癌的效果评价

10 放射性粒子近距离治疗前列腺癌的并发症

正 文

实验一 不同活度放射性粒子(125I 粒子源)持续极低剂量率γ射线照射对前列腺癌细胞杀伤机制的研究

1 实验目的

2 实验材料

3 实验方法

4 观察方法

5 实验结果

6 讨论

实验二 125I 粒子组织间植入治疗裸鼠移植性前列腺癌的实验研究

1 实验目的

2 实验材料

3.实验方法

4 实验结果

5 讨论

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢