二苯乙烯苷通过调节ROS-NO通路保护6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡

摘要

帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）是一种常见的神经系统退行性疾病。其主要病理特点为黒质致密部(Substantianigraparscompact,SNpc)含黑素的多巴胺（Dopamine,DA）能神经元选择性变性缺失，主要临床特点为静止震颤，肌僵直，姿态不稳以及运动缓慢。目前，PD的病因和发病机制尚不明确。但大量研究已经表明氧化应激和线粒体功能障碍与PD的发病机制密切相关。
　　6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）是DA的一种羟化衍生物，广泛的用于PD体内外模型的建立。其具有神经毒性并且能够诱导体内外DA能神经元的凋亡。PC12细胞株来源于大鼠嗜铬细胞瘤，它具有类似于多巴胺合成、代谢和转运系统的功能，与中脑多巴胺能神经元特性十分接近。
　　二苯乙烯苷（2,3,5,4-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG）是从中草药何首乌中提取的有效活性成分之一。其具有抗氧化，抗炎，以及改善学习记忆的作用。有研究已经证实TSG可改善老年痴呆小鼠的学习记忆能力，具有神经保护作用。最近，我们的研究表明TSG对MPP+诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用。
　　为了进一步研究TSG的神经保护作用，本研究选择与DA能神经元特性相似的PC12细胞和具有神经毒素的6-OHDA建立体外PD模型，观察TSG对6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡是否有保护作用，并对其作用机制做初步探讨。
　　【目的】：
　　1.用神经诱导因子处理细胞使之具有类似DA的性能。
　　2．建立PD体外模型，筛选出6-OHDA诱导PC12细胞凋亡的有效浓度和TSG对6-OHDA诱导PC12细胞凋亡的有效保护浓度；
　　3．观察TSG对6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡的影响；
　　4．研究TSG减轻6-OHDA诱导PC12细胞凋亡可能的机制。
　　【方法】：
　　1.设立空白对照组，25，75，100，125，150，200和300μmol/L6-OHDA浓度组作用于PC12细胞24h，筛选6-OHDA实验处理有效浓度，筛选出6-OHDA有效浓度为75μmol/L；设立空白对照组，1，5，10，20，50，100，200μmol/LTSG浓度组作用PC12细胞24h，观察TSG单独处理细胞对细胞的影响；设立空白对照组，1，5，10，20，50，100，200μmol/LTSG浓度组作用PC12细胞24h，再用6-OHDA（75μmol/L）处理24h，筛选TSG实验处理有效浓度，筛选出最佳TSG预处理组浓度为10，20，50μmol/L。
　　2.设立正常对照组，单独TSG处理组，6-OHDA处理组，不同浓度TSG预处理组（10，20，50μmol/L），用MTT比色法检测细胞活力；Hoechst33258染色观察细胞核形态变化；流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡百分率；TUNEL染色观察细胞DNA断裂情况；
　　3.通过全自动荧光酶标仪检测细胞内ROS和NO水平；
　　4.通过Elisa检测试剂盒检测3-NT蛋白水平；
　　5.通过WesternBlot法检测细胞中iNOS和nNOS蛋白的表达水平；
　　【结果】：
　　1.MTT比色法检测观察，与对照组相比，75μmol/L6-OHDA处理PC12细胞24h后细胞活力为（52.6±1.3）％（P<0.01）。TSG预处理细胞24h后，再用75μmol/L6-OHDA处理24h，与6-OHDA组（52.6±1.3）％相比，10，20，50μmol/LTSG预处理组细胞活力分别上升为（66.6±3.2）％（P<0.01），（73.0±1.6）（P　　2.Hoechst33258染色观察到，正常细胞核显示蓝色，均匀淡染，边缘光滑整齐，6-OHDA处理组细胞核呈致密浓染，细胞染色质皱缩，显示亮蓝荧光，甚至可见细胞核断裂，呈现致密的颗粒荧光。而用TSG（10，20和50μmol/L）预处理细胞后，上述细胞凋亡特点明显改善。单独TSG处理组对细胞形态学无明显影响。
　　3.FCM结果显示，正常组，仅TSG组，6-OHDA处理组，TSG（10，20和50μmol/L）预处理组凋亡细胞百分率分别为1.8％，1.6％，35.2％，30.7％和18.7％，13.6％。
　　4.TUNEL染色显示，与正常对照组（4.8±1.4）％相比，6-OHDA组TUNEL阳性细胞数增加到（30.6±2.0）％（P<0.01），而TSG（10，20和50μmol/L）组TUNEL阳性细胞数则分别下降为（22.8±1.0）％（P<0.01），（19.4±0.9）（P<0.01）和（11.6±1.1）％（P<0.01）。仅TSG组对细胞形态无明显影响。
　　5.全自动荧光酶标仪检测ROS和NO观察到，与正常对照组细胞内ROS水平（99.8±3.1）％相比，6-OHDA组细胞内ROS水平增加到（178.4±9.4）％（P<0.01），而TSG（10，20和50μmol/L）预处理组细胞内ROS水平则分别下降为（169.6±8.8）％，（156.0±9.1）％（P<0.01），（119.2±7.4）％（P<0.01）；仅TSG组对细胞内ROS影响不明显。与正常对照组细胞内NO水平（98.8±4.1）％相比，6-OHDA组细胞内NO水平增加到（308.6±23.6）％（P<0.01），而TSG（10，20和50μmol/L）预处理组细胞内NO水平则分别下降为（287.6±23.2）％，（236.0±34.8）％，（158.0±14.6）％（P<0.01），仅TSG处理对细胞内NO影响不明显。
　　6.Elisa检测试剂盒检测3-NT显示，与正常对照组细胞内3-NT水平（4.4±0.3）％相比，6-OHDA组细胞内3-NT水平增加到（18.2±0.8）％（P<0.01），而TSG（10，20和50μmol/L）预处理组细胞内3-NT水平则分别下降为（16.7±0.9）％，（14.6±1.3）％（P<0.05），（10.1±0.7）％（P<0.01），仅TSG处理对细胞内3-NT影响不明显。
　　7.WesternBlot方法检测结果表明，TSG（10，20和50μmol/L）预处理组iNOS和nNOS表达水平较6-OHDA处理组明显依次减弱。
　　【结论】：
　　1.在一定浓度范围内，TSG以剂量依赖的方式能够减轻6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡。
　　2.TSG减轻6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡与调节ROS-NO通路有关。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾一

文献回顾二

正文

实验一 TSG 对 6-OHDA 诱导的 PC12 细胞损伤的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 TSG 抑制 MPP+诱导的 PC12 细胞凋亡的作用机制探讨

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢