调控NK细胞杀伤肿瘤细胞免疫新分子的发现和机制研究

摘要

在肿瘤细胞发生、发展过程中，作为固有免疫系统的重要组成细胞，NK（naturalkiller）细胞不仅通过分泌穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，还可以通过分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能，进而在抗肿瘤免疫中发挥重要的作用。另一方面，在免疫细胞攻击肿瘤细胞的同时，肿瘤细胞也产生多种机制逃逸免疫系统的监视。肿瘤细胞可通过分泌的可溶性因子或其表面表达的配体，直接或间接地调节免疫细胞的功能，抑制免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤，从而维持肿瘤本身的生存发展。因此如何调控NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，增强肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性，是目前肿瘤免疫治疗研究中的关键问题。
　　NK细胞的杀伤活性受到NK细胞表面受体和细胞因子等多种分子的调控。NK细胞表面受体和细胞因子受体被活化后，可通过转录因子Ets-1（E26transformation-specific1）、MEF（myocyteenhancerfactor）、AP-1（activatorprotein1）和HMBOX1（Homeoboxcontaining1）等向NK细胞内部传递信号，调控相关基因的转录和表达，调节NK细胞的发育成熟和活化杀伤。
　　作为一类新的调控分子，小分子RNA（microRNAs,miRNAs）在免疫系统发育和功能调节中的作用日益受到重视。已有研究表明，miRNAs分子广泛参与了对T细胞、B细胞和巨噬细胞发育、分化和效应功能的调节，而其在NK细胞活化和杀伤过程中的作用尚待进一步深入研究。为了探讨miRNAs分子在NK细胞活化杀伤中的调节作用，我们通过miRNA芯片检测了抗人CD226抗体LeoA1交联的NKL细胞和对照抗体交联的NKL细胞中的miRNAs分子表达谱变化，筛选出let-7c、miR-21、miR-30c、miR-30c-1*、miR-181d和miR-200a*等6个表达水平显著下调的miRNA分子。其中miR-30c-1*可靶向结合抑制性转录因子HMBOX1（homeoboxcontaining1）3’UTR（untranslatedregion）区，通过抑制其蛋白表达，增加NKL细胞表面膜型TNF-α（transmembraneTNF-α，mTNF-α）的表达，进而促进体内外NKL细胞对人肝癌细胞的杀伤功能。
　　在实体肿瘤发生发展过程中，肿瘤微环境的缺氧缺血等不利因素会引起肿瘤细胞发生内质网应激（endoplasmicreticulumstress,ERstress），为纠正内质网应激，肿瘤细胞会启动非折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse,UPR）。UPR不仅促进肿瘤细胞的生存和发展，降低肿瘤细胞对放化疗的敏感性，同时亦影响机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫应答。目前有关UPR在调控肿瘤细胞对NK细胞杀伤敏感性中的作用及其分子机制的研究尚未见文献报道。我们的研究发现UPR可诱导肝癌细胞系SMMC7721和HepG2细胞表面重要的NK细胞活化性受体的配体MICA/B（MHCclassIrelated-chaingeneA/B）、CD112和CD155表达水平下调，降低肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性。进一步研究发现，UPR三条信号通路中的ATF6（activatingtranscriptionfactor6）和IRE1α（inositol-requiringenzyme1）通路参与了对MICA/B、CD112和CD155表达水平的调节，而PERK（pancreaticERkinase-likeERkinase）通路则不参与调节这些分子的表达。更为重要的是，我们发现IRE1α可通过上调ERAD（ERstress-associateddegradation）分子HRD1的表达，促进其对MICA/B、CD112和CD155蛋白的降解，进而下调MICA/B、CD112和CD155蛋白表达。为进一步证实上述分子在体内存在相似的调节机制，我们检测了人不同分期肝癌组织中UPR相关分子GRP78（glucose-regulatedproteinof78kDa）、HRD1以及MICA/B、CD112和CD155的表达，发现随着肿瘤进展，GRP78和HRD1表达水平上调，而MICA/B、CD112和CD155表达水平下调，进一步相关性分析发现HRD1表达水平与肿瘤分期和GRP78表达水平呈正相关，而与MICA/B、CD112和CD155表达水平呈负相关。
　　综上所述，一方面，我们的研究结果证实miRNA分子参与了对NK细胞活化杀伤功能的调控，首次发现了可促进NK细胞活化杀伤的新分子——miR-30c-1*，并深入探讨了其对NK细胞活化杀伤功能调控的分子机制。另一方面，我们发现肿瘤细胞亦可调节NK细胞的活化杀伤功能，证实肝癌细胞在发生发展过程中，可通过UPR通路下调其表面NK细胞活化性受体相应配体的表达，降低其对NK细胞杀伤的敏感性，这可能是肝癌细胞的免疫逃逸机制之一。更为重要的是，我们发现肝癌细胞表面这些配体分子表达水平下调是受到UPR通路中ATF6和IRE1α信号通路调节的，其中IRE1α可通过上调HRD1表达促进ERAD作用，下调NK细胞活化性受体配体的蛋白表达水平。这些调控NK细胞对肝癌细胞杀伤功能的免疫新分子的发现及其调控机制的研究，不仅为深入理解肿瘤细胞的免疫逃逸机制提供了新的视角和思路，而且为肿瘤免疫治疗研究提供了重要的理论和实验依据。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 NK细胞在肿瘤免疫中的作用及其调控机制

2. UPR信号通路及其对NK细胞杀伤功能的调控

正文

实验材料

1 实验动物和细胞系

2 主要试剂

3 主要缓冲液配方

4 引物、miRNA mimics及siRNA序列

5 主要仪器

研究内容及结果

实验一 miRNA对NK细胞活化杀伤功能的调控及作用机制研究

1 方法

2 结果

3 讨论

实验二 非折叠蛋白反应诱导肝癌细胞抵抗NK细胞杀伤及分子机制

1 方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

博士研究生期间参加会议情况

致谢