高产油海洋微藻的筛选及微拟球藻QA2优化培养体系的建立

摘要

随着世界工业化进程的加速，化石燃料的需求越来越大，然而其不可再生性，使得生物能源的开发和利用受到广泛的关注。富油微藻因具有生物量大、生长周期短、易培养及脂类含量高等特点，被认为是最具潜力的油脂生物质资源，微藻可以通过光合作用吸收煤电厂和化工厂等排放的二氧化碳来制备生产生物柴油，成为制备生物能源的良好的原料。本实验通过对海洋微藻的分离筛选及产油分析，筛选出有生产价值的高产油微藻藻株，建立优化培养体系，并研究了不同营养盐对海洋微藻生长及油脂积累的影响，为生物柴油的开发和生产提供最佳的微藻种质资源，为规模化培养提供资料。 本文对从我国不同海域采集来的水样进行分离纯化及富油微藻的筛选，并对其中一株富油微藻进行优化培养以及不同营养盐下生长及油脂积累分析。 主要研究结果如下: 1、本实验分离得到了数十株海洋绿藻，对24株海洋绿藻藻株进行了生长周期、总脂及脂肪酸的含量初步测定。筛选出一株微拟球藻QA2生长周期最短（8天），脂肪酸含量最高达13.31％（占干重），非常适合做生物柴油。 2、通过研究不同条件下QA2光合放氧速率和叶绿素荧光参数的变化，确定了QA2的最佳培养条件。QA2培养的最优条件为:温度18℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，pH8.8，以(NH2)2CO为氮源，添加浓度为4.41mmol/L，以NaH2PO4为磷源，添加浓度为0.036mmol/L，添加外源柠檬酸为2.38mmol/L，分批加入(0.238 mmol·L-1·d-1)。在该培养条件下，QA2的生长速度明显加快，并促进了油脂和脂肪酸的积累，优化通气产油率、脂肪酸日产率达19.285±0.615、6.300±0.063mg·L-1·d-1，是基础培养组的2.6、7.4倍。 3、不同氮源对于QA2生长及油脂积累的影响依次为:(NH2)2CO＞NaNO3＞NH4Cl。以(NH2)2CO为氮源，生长速度快，产油率、脂肪酸日产率为最佳。进一步研究了不同(NH2)2CO、NaNO3浓度培养条件下对于QA2生长及油脂积累的影响，结果表明:以(NH2)2CO为氮源，在3.08mmol/L时为生物量最高，为26.87mg/L，产油率、脂肪酸日产率达到了9.417±0.045、1.725±0.213 mg·L-1·d-1。 4、以NaH2PO4为磷源，研究了不同初始磷浓度对QA2生长及脂类积累的影响，结果表明:不同初始磷浓度对QA2生长影响不明显，在0.036mmol/L浓度时就能满足生长及油脂积累的需要。 5、研究了铁浓度培养条件下QA2的生长及油脂积累，结果显示:高浓度抑制生长，低浓度促进生长，浓度铁为0.0524和0.175mol/L时，QA2产油率呈现“双峰”的现象，分别为5.702±0.506、5.899±0.289 mg·L-1·d-1。而脂肪酸日产率呈现“单峰”的现象，铁浓度0.175mol/L为最高1.136±0.056 mg·L-1·d-1。 6、研究了外源柠檬酸浓度条件下QA2的生长及油脂积累，结果显示:添加适量的柠檬酸可以促进QA2的生长。柠檬酸添加浓度为1.42mmol/L时于QA2产油率、脂肪酸日产率为最佳达到了6.741±0.596、1.474±0.095 mg·L-1·d-1，是对照组的1.5、1.8倍，且此浓度下生长最快。 7、研究了以NaHCO3、CH3COONa、Na2CO3为碳源对QA2生长及油脂积累的影响，研究发现:碳源的添加对QA2油脂的积累均有一定的促进作用。在添加CH3COONa和Na2CO3条件下均能明显的促进油脂、脂肪酸的积累。添加CH3COONa更有利于月旨肪酸的积累，从生产生物柴油的角度，CH3COONa更适合作为碳源，添加浓度为15mmol/L，其产油率为20.800mg·L-1·d-1，脂肪酸日产率为6.636 mg·L-1·d-1，分别是对照组的2.86、5.67倍。 8、利用盐浓缩的方法研究盐度培养对QA2生长及油脂积累的影响，因外界蒸发等造成的高盐度，对QA2的生长和脂肪酸的积累影响不大，另外发现，盐度为15时，QA2能很好的积累油脂，此盐度可以作为生产上的使用。 9、缺素培养研究结果表明，营养盐的缺乏诱导了藻细胞的油脂积累。氮磷缺乏培养5d时，脂肪酸含量高达15.33％，提高了40.51％，产油率高达31.434mg·L-1·d-1，提高了10.65％，脂肪酸日产率高达8.143 mg·L-1·d-1，提高了53.79％。同时，倍减缺素实验结果表明:稀释30％培养3天时，QA2的产油率为25.695 mg·L1·d-1，提高了18.1％。稀释50％培养3天时，QA2的产油率为23.227 mg·L-1·d-1，提高了7.0％。在100％减缺素培养至5天时，脂肪酸日产率提高了35.4％。营养盐缺乏不利于刺激藻细胞的生物量的积累，但能刺激油脂积累。

目录

声明

摘要

第一章 微藻生物柴油的研究进展

1 生物柴油基本概况

1．1 生物柴油的优势

1．2 生物柴油的原料来源

1．3 限制生物柴油发展的主要因素

2 海洋微藻生产生物柴油的研究进展

2．1 海洋微藻简介

2．2 海洋微藻生产生物柴油的优势

2．3 海洋微藻生产生物柴油的机理

3 海洋绿藻生产生物柴油的研究进展

3．1 海洋绿藻简介

3．2 海洋绿藻应用研究进展

4 影响海洋绿藻生物量及油脂积累的因素

4．1 环境因子对海洋绿藻生物量及油脂积累的因素

4．2 营养盐对海洋绿藻生物量及油脂积累的因素

5 目前海洋微藻生产生物柴油存在的问题

6 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

1 海洋微藻的分离、纯化与培养

1．1 海洋微藻分离纯化的主要方法

1．2 海洋微藻的培养与保存

2 主要相关仪器设备

3 海洋绿藻QA2分子生物学鉴定

3．1 QA2基因组DNA的提取

3．2 PCR扩增及其产物的纯化、克隆

4 海洋绿藻生物量的测定

5 海洋绿藻总脂及脂肪酸的测定

5．1 微藻细胞总脂及脂肪酸的测定

5．2 油脂产率分析

6 不同培养条件下QA2叶绿素荧光参数、净光合放氧速率的变化

7 海洋绿藻的优化培养及其细胞的生长、脂肪酸及总脂含量变化

8 营养盐对海洋绿藻的生长及油脂积累的影响

9 海洋绿藻两步培养方法

9．1 单一缺素对海洋绿藻的生长及油脂积累的影响

9．2 倍减缺素对海洋绿藻的生长及油脂积累的影响

第三章 结果与分析

1 高产油海洋微藻的筛选

1．1 海洋微藻的分离纯化

1．2 高油脂海洋微藻藻株的筛选

1．3 QA2分子生物学鉴定结果

1．4 QA2脂肪酸组成分析

2 QA2优势生长条件的建立

2．1 QA2叶绿素荧光参数及净光合放氧速率的变化

2．2 QA2的优势培养体系

3 营养盐对QA2的生长及油脂积累的影响

3．1 不同氮源培养条件下QA2的生长及油脂积累

4．2 磷源浓度培养条件下QA2的生长及油脂积累

4．3 铁浓度培养条件下QA2的生长及油脂积累

4．4 外源柠檬酸浓度培养条件下QA2的生长及油脂积累

4．5 碳源培养条件下QA2的生长及油脂积累

5 盐度对QA2的生长及油脂积累的影响

6 两步培养对QA2的生长及油脂积累的影响

6．1 单一缺素对QA2的生长及油脂积累的影响

6．2 倍减缺紊对QA2的生长及油脂积累的影响

第四章 讨论与分析

1 高产油海洋微藻的筛选

2 QA2优势生长条件的建立

3 营养盐对QA2的生长及油脂积累的影响

3．1 氮源对于QA2油脂积累影响

3．2 磷源对于QA2油脂积累影响

3．3 铁对于QA2油脂积累影响

3．4 柠檬酸对于QA2油脂积累影响

3．5 碳源对于QA2油脂积累影响

4 高盐度对QA2的生长及油脂积累的影响

5 两步培养对QA2的生长及油脂积累的影响

参考文献

致谢