SDF-1/CXCR4促进骨髓间充质干细胞迁移并参与牵张成骨的研究

摘要

牵张成骨技术已在颌面外科领域广泛应用，但我们却对其骨再生详细机理了解甚少。已知骨髓间充质干细胞（MSCs）在牵张成骨中起到了非常重要的作用，是骨再生的关键。MSCs被证实可向机体受损部位迁移，而且这种迁移与多种趋化因子密切相关，基质细胞衍生因子-1（SDF-1）就是其中最重要的一员。本课题设计了一系列实验，在大鼠下颌骨牵张成骨模型中，验证机体是否募集全身的MSCs来“帮助”实现快速的骨再生。课题旨在进一步探究牵张成骨的具体机理，为缩短牵张成骨临床治疗时间提供新的思路，同时也为继续优化牵张策略提供循证依据。课题主要分为以下5部分：
　　1大鼠单侧下颌骨牵张成骨模型的建立
　　目的：采用自行设计的下颌骨牵张器，建立大鼠单侧下颌骨牵张成骨模型。方法：以15只SD雄性大鼠作为实验动物，在全麻下行右侧下颌骨牵张器植入术，左侧下颌骨行骨折内固定术作为对照。术后经5天的延迟期后，以0.2mm/12h的速率进行连续牵张共10天，总牵张长度为4.0mm。于牵张结束当天、固定期2周、4周分批处死大鼠（n=5），行大体标本检查及组织切片HE染色。结果：15只大鼠均耐受手术，牵张器固定良好，右侧下颌骨均被成功延长。牵张间隙的平均宽度为3.5mm，为预期间隙宽度的87.5％。HE染色示固定期4周后新生骨已接近正常骨组织。结论：课题组自行设计和研制的外置型下颌骨牵张器性能稳定、操作方便，能够满足大鼠单侧下颌骨牵张成骨的要求。该模型可行性与重复性俱佳，可为牵张成骨进一步分子及基因机制的研究提供一个很好的实验平台。
　　2大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及鉴定
　　目的：贴壁筛选法分离、培养、纯化大鼠MSCs，并对趋化因子受体CXCR4在MSCs的表达进行鉴定。方法：全骨髓贴壁筛选法培养大鼠MSCs，并进行生长曲线测定，成骨、成脂诱导分化，细胞表面标志物检测，并对细胞表面及胞内CXCR4的表达进行流式细胞术鉴定。结果：所培养的大鼠MSCs可在体外迅速大量增殖，其生长周期、形态特征、增殖规律符合典型的MSCs增殖特点；可向成骨细胞、脂肪细胞方向成功分化；流式细胞术鉴定其细胞表面标志物特征为CD29、CD44、CD90阳性，CD34和CD45阴性，细胞表面CXCR4表达率为16.5％，细胞内CXCR4表达率为83.2％。结论：培养的大鼠MSCs细胞成分均一，具有多向分化潜能，细胞表面及胞内均表达CXCR4。
　　3SDF-1在大鼠下颌骨DO及骨折中的表达
　　目的：检测SDF-1在牵张成骨新生骨痂中的表达情况，并与其在骨折愈合中的表达对比。方法：SD大鼠40只接受右侧下颌骨牵张成骨、左侧下颌骨骨折内固定手术，在术后当天、3、6、9、12、15、18、21天时分批（n=5）处死动物并取材，进行免疫组织化学检测及ELISA定量检测。结果：免疫组化染色显示，SDF-1主要表达于成骨细胞及微血管周围，在牵张成骨新生骨痂中表达较强烈，在骨折处骨痂中亦有表达。ELISA检测结果发现，SDF-1在骨切开术后升高3倍，在骨折区，SDF-1表达在术后1周后逐步下降，而在牵张成骨区，牵张开始后再次上升达到基础水平5倍，牵张结束1周后基本下降至基础水平。结论：SDF-1在牵张成骨中表达显著上调，其上调在牵张期内更为显著。
　　4SDF-1促进MSCs迁移的体外实验
　　目的：在Transwell迁移小室模型中研究不同浓度的SDF-1以及阻断SDF-1/CXCR4通路后对MSCs迁移的影响。方法：Transwell迁移小室模型中，上室内加入2×105/ml密度的MSCs单细胞悬液500μL，下室内加入1.5mL含不同浓度SDF-1α(0、100、200、300、400ng/mL)的DMEM培养液，培养24小时后计数迁移细胞。另外将MSCs在含CXCR4受体阻断剂AMD3100（5μg/mL）的DMEM培养液中孵育30分钟后制备单细胞悬液，再次重复上述实验。结果：当下室加入SDF-1α后，MSCs迁移数目明显增加，无SDF-1α组与其余各组相比有显著差异（P<0.05），在100、200、300ng/mL各组间差异也具有统计学意义（P<0.05），而300、400ng/mL两组之间差异无统计学意义（P>0.05）；MSCs在含CXCR4受体阻断剂AMD3100（5μg/mL）的DMEM培养液中孵育后，细胞迁移数目与相同浓度SDF-1α诱导组相比，有显著减少（P<0.05）。结论：SDF-1对MSCs有明显的浓度依赖性趋化作用，且这种趋化作用可被CXCR4的阻断剂AMD3100不完全抑制。
　　5静脉输入MSCs迁移到DO及SDF-1对迁移的促进作用
　　目的：观察静脉输入GFP标记的MSCs后，在牵张成骨新生骨痂中的迁移情况，以及增强或阻断SDF-1/CXCR4途径对MSCs迁移的影响。方法：SD大鼠32只均接受右侧下颌骨牵张成骨手术并分为4组（n=8），均在牵张期第5天接受细胞输入：A组尾静脉输入GFP-MSCs单细胞悬液500μL；B组尾静脉输入经AMD3100预处理的GFP-MSCs单细胞悬液500μL；C组下颌骨牵张区局部注射100ngSDF-1，1小时后尾静脉输入GFP-MSCs单细胞悬液500μL；D组下颌骨牵张区局部注射100ngSDF-1，1小时后尾静脉输入经AMD3100预处理的GFP-MSCs单细胞悬液500μL。24小时后每组处死4只大鼠，进行冰冻切片及荧光显微镜下观察、计数。固定期2周后处死其余大鼠并进行组织学切片及HE染色，测量其骨量百分比。结果：牵张区内大量纤维网状支架沿牵张方向分布，GFP-MSCs散在分布于网状支架之间。细胞计数示A组迁移的GFP-MSCs数目为56±10.3/200×视野，B组为17±3.5/200×视野，C组为62±11.7/200×视野，D组为91±13.5/200×视野。B组与A组相比，D组与C组相比，其差异均具有统计学意义（P<0.05）。组织计量学分析显示，D组骨量百分比（BV/TV）明显大于其余3组（P<0.05）；而B组骨量百分比（BV/TV）则明显小于其余3组（P<0.05）。结论：在牵张成骨的牵张期内，静脉输入的MSCs可从血循环迁移至牵张间隙，且迁移细胞的数量与牵张区局部的SDF-1浓度呈正相关；在预先封闭MSCs的CXCR4受体后，迁移细胞数显著减少；牵张区中固定期骨成熟程度与迁移细胞的数量呈正相关。
　　小结：本课题通过大鼠单侧下颌骨牵张成骨模型，首次发现SDF-1在骨切开术后及牵张期均表达上调；首次证明在牵张成骨中，MSCs可由血循环迁移至牵张间隙；首次提出SDF-1/CXCR4轴在牵张成骨中诱导MSCs迁移的作用。本课题对牵张成骨的分子机理作出了进一步探索，课题研究结果为牵张成骨的干细胞全身应用策略提供直接依据，也为临床应用SDF-1促进新骨生成、缩短牵张成骨治疗时间提供了理论基础。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 牵张成骨的概况及其在颌面部的应用现状

2 牵张成骨的生物学基础及分子机理研究进展

3 骨髓间充质干细胞多向分化及迁移研究进展

4 趋化因子与其受体及 SDF-1/CXCR4 研究进展

正文

实验一 大鼠单侧下颌骨牵张成骨模型的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验二 大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验三 SDF-1 在大鼠下颌骨 DO 及骨折中的表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验四 SDF-1 促进 MSCs 迁移的体外实验

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验五 静脉输入 MSCs 迁移到牵张区及 SDF-1对迁移的促进作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢