呼吸道感染患儿超广谱β-内酰胺酶细菌的耐药性及基因重组菌株的抗药活性分析

摘要

背景：
　　呼吸道感染是小儿时期最常见的疾病,细菌是其感染的重要致病原。β-内酰胺类抗生素是儿科首选的抗感染治疗药物,在其选择性压力下,细菌产生了超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)。产酶细菌具有多种耐药基因,对多种抗生素产生耐药,不同国家和地区、不同时期,产酶菌株的分布、所含的耐药基因及产生的抗药活性不尽相同。
　　目前,ESBLs菌株所产的酶型已超过700余种,主要包括TEM型、SHV型、CTX-M型及其它少见类型,各型及亚型间酶的耐药性有所差异。自2000年后,CTX-M型酶逐渐替代TEM型、SHV型酶,成为全球流行的主要酶型。对头孢他啶敏感、对头孢噻肟耐药,是产CTX-M型酶细菌的主要耐药特征。如何合理选用抗生素,如何能更有效地检测、治疗产酶菌株的感染、防止其流行,是我们临床上亟待解决的问题。
　　目的：
　　1.了解西安地区呼吸道感染患儿产ESBLs细菌总的耐药特征。
　　2.了解西安地区呼吸道感染患儿产ESBLs细菌的耐药基因分布情况。
　　3.通过对流行的主要酶型作原核表达,了解单一酶型产酶菌株的耐药特征,为临床特异性诊断及治疗其感染奠定基础。
　　方法：
　　1.对2011.7—2012.10我院住院的呼吸道感染患儿行咽拭子及痰细菌培养,分离获得ESBLs阳性细菌,用K-B纸片扩散法检测其对抗生素的耐药状况。
　　2.设计TEM、SHV、CTX-M-1组、CTX-M-2组、CTX-M-9组基因型引物,PCR方法检测ESBLs细菌的耐药基因分布情况,并通过基因测序获得西安地区现阶段流行的ESBLs耐药基因亚型。
　　3.通过基因重组技术构建原核表达载体,将重组质粒转化入大肠感受态细胞,IPTG诱导表达单一酶型的ESBLs,用K-B纸片扩散法分析其抗药活性。
　　结果：
　　1.呼吸道感染患儿中检出产ESBLs细菌共47株,主要为大肠埃希菌26株和肺炎克雷伯菌21株(产酶率分别为52.0％,47.7%)。产酶细菌对头孢类抗生素高度耐药(头孢他啶、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松耐药率为100%),对头孢吡肟部分耐药(耐药率26.9%~38.1%);对β-内酰胺类抗生素/酶抑制剂复合物耐药率有差异(依次为氨苄西林/舒巴坦38.5%~85.7%、头孢哌酮/舒巴坦19.2%~28.6%、哌拉西林/他唑巴坦7.7~14.3%);对亚胺培南及美洛培南耐药率为0。
　　2.产ESBLs细菌耐药基因型流行以CTX-M-9组最多见(51.1%),然后依次为TEM型(29.8%),CTX-M-1组(21.3%),SHV型(10.6%),CTX-M-2组检出率为0;DNA基因测序显示CTX-M-9组基因亚型以CTX-M-14为主。
　　3.重组质粒pET32a-CTX-M-14双酶切鉴定显示在5900bp及876bp处各见一目的条带。IPTG诱导BL21-pET32a-CTX-M-14转化菌,SDS-PAGE电泳显示在33KDa附近处见一目的蛋白;重组CTX-M-14型酶大肠埃希菌菌株的抗药活性显示:对头孢噻肟、头孢呋辛、头孢曲松耐药,头孢他啶、头孢吡肟敏感;对酶抑制剂均敏感;对亚胺培南及美洛培南均敏感。
　　结论：
　　1.儿童呼吸道感染革兰阴性杆菌产酶严重,主要见于大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌。产ESBLs细菌具有多重耐药的表型特征,对头孢类抗生素高度耐药,对酶抑制剂复合物部分耐药,对碳青霉烯类抗生素尚未发现耐药菌株。
　　2.西安地区呼吸道感染患儿ESBLs细菌对广谱头孢菌素耐药的主要原因是产生了CTX-M-9组耐药基因,其中以CTX-M-14亚型最多见。
　　3.利用基因重组技术成功表达CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶,证实其抗药活性具备CTX-M型产酶菌株的典型特征,为进一步制备单克隆抗体,用免疫学方法早期诊断及特异性治疗CTX-M型产酶菌株的感染奠定基础。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1．ESBLs的定义

2. ESBLs耐药基因流行特点

3．CTX-M型ESBLs特性

正文

第一部分 呼吸道感染患儿产ESBLs细菌的分离、鉴定及耐药性研究

1材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 呼吸道感染患儿产ESBLs细菌的耐药基因分布

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 重组CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶菌株的构建、表达及抗药活性分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢