昆虫新细胞系的建立及高表达克隆株的筛选

摘要

众所周知，实验室中广泛使用的Tn5B1-4（商品名High Five）是一株病毒敏感性高、重组蛋白表达水平高的细胞系，但其生物特性不稳定，长期的传代培养会引起生长特性的改变。最近在Tn5B1-4细胞系中发现了一种名为TNCL的诺达病毒。本研究建立了一株新的粉纹夜蛾细胞系，并对已有的QB-Tn9-4s细胞系进行单细胞克隆，以获得优良的无毒细胞株，主要结果如下: 1.以Sf9和Tn5B1-4细胞分别为阴性对照与阳性对照，对亲本QB-Tn9-4s进行TNCL检测。对AcMNPVC侵染和未侵染的细胞系进行RT-PCR分析，最后只有Tn5B1-4得到目的扩增产物，证明QB-Tn9-4s不携带TNCL病毒。对QB-Tn9-4s进行单细胞克隆，筛选得到两个克隆株，分别命名为QB-CL-A和QB-CL-B。 2.QB-Tn9-4s及其克隆株都是悬浮细胞系。QB-CL-A和QB-CL-B都由比亲代QB-Tn9-4s(18.2×57.7μm)稍小的梭形细胞组成，大小约为18.4×49.4μm，比Tn5B1-4(16.6×38.4μ m)稍大。 3.测定了克隆株的生长速率和群体倍增时间。其中QB-CL-B生长速率比亲代QB-CL-A、QB-Tn9-4s和Tn5B1-4稍快，在第5天细胞密度达最大值1.65×106cells/mL，QB-CL-B、QB-CL-A、QB-Tn9-4s和Tn5B1-4的群体倍增时间分别为20.2、21.7、20.9和22.7h。 4.病毒侵染试验表明，QB-CL-A、QB-CL-B、QB-Tn9-4s与Tn5B1-4对野生型AcMNPV的敏感性相近，感染率均达到93％。克隆株QB-CL-B的出芽性病毒产量(3.76×107 TCID50/mL)高于亲代QB-Tn9-4s(3.37×107TCID50/mL)和Tn5B1-4(2.98×107 TCID50/mL)。QB-CL-A与QB-CL-B的多角体产量分别为111.7和102OBs/cell。 5.重组蛋白表达水平测定结果表明，克隆株QB-CL-B重组蛋白表达水平比QB-Tn9-4s、QB-CL-A和Tn5B1-4稍高。QB-CL-B的分泌性碱性磷酸酶(secretedalkaline phosphatase，SEAP)产量分别为QB-Tn9-4s、QB-CL-A和Tn5B1-4的3.3、2.1和1.2倍。QB-CL-A和QB-CL-B的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)表达水平分别比QB-Tn9-4s和Tn5B1-4高出15％和40％，但QB-CL-A的SEAP表达量却很低。 6.以Tn5B1-4和Sf9为对照，对粉纹夜蛾卵进行RT-PCR分析，未获得目的扩增产物，证明试验所用粉纹夜蛾卵不携带TNCL病毒。本研究中以此为材料，建立了新的粉纹夜蛾胚胎细胞系，目前生长状况良好。

目录

声明

摘要

前言

1 昆虫细胞培养

2 昆虫细胞系的应用

3 研究目的及意义

材料与方法

1 试验材料

2 试验方法

2．1 粉纹夜蛾的饲养

2．2 TNMFH培养基的配制

2．3 细胞培养

2．4 细胞的冻存与复苏

2．5 细胞克隆

2．6 细胞克隆株生物学特性的测定

2．7 TNCL病毒检测

结果与分析

1 克隆株细胞形态

2 克隆株的TNCL病毒检测

3 细胞冻存与复苏

4 克隆株细胞生长曲线和群体倍增时间的测定

5 克隆株对病毒敏感性与病毒多角体产量的测定

6 出芽型病毒产量测定

7 重组蛋白AcMNPV-β-gal表达水平分析

8 重组蛋白AcMNPV-SEAP表达水平分析

9 新细胞系形态

10 新细胞系的TNCL病毒检测

讨论

结论

参考文献

附录 本文所用的缩略语

导师组意见

致谢

硕士期间发表的学术论文