朊病毒感染后葡萄糖转运体与葡萄糖摄取能力的变化及其机制初探

摘要

朊病毒病是一类慢性神经退行性疾病,也称为可传播性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies,TSEs)。这类疾病的共同的病理特点是:进行性脑组织空泡样变(即脑组织海绵状变性)、神经元丢失、淀粉样斑块形成和星形胶质细胞增生等。目前已在人类和其他哺乳类动物中发现了多种朊病毒病,并可由动物传染至人类,动物之间也存在着跨种属传播。研究认为,朊病毒病的病原体是由细胞内正常朊蛋白(PrPC)错误折叠而来的异常的朊蛋白(PrPSc)。不同的错误折叠形式会导致与不同朊病毒毒株相关的PrPSc产生,而不同朊病毒毒株的感染又会导致具有不同潜伏期、不同PrPSc的聚集形式以及不同程度脑组织局部病变等不同临床表型的朊病毒病的发生。
　　葡萄糖是哺乳动物体内主要的供能物质,更是脑组织中的关键供能物质。哺乳动物绝大多数体细胞是通过经葡萄糖转运体(Glucose transporters,GLUTs)易化的形式来摄取葡萄糖的。GLUTs有多种异构体,它们的分布均具有组织和细胞的特异性。其中脑组织中两个最重要的葡萄糖转运体是葡萄糖转运体1(Glucose transporter1,GLUT1)和葡萄糖转运体3(Glucose transporter3,GLUT3),它们均属于可溶性载体家族2(Solute carrier family,SLC2)。其中GLUT1主要分布在血脑屏障内皮细胞及星型胶质细胞上,负责将血液循环中的葡萄糖转运到脑组织及星型胶质细胞中;GLUT3负责神经元的葡萄糖摄取,是神经元中最重要的葡萄糖转运体。已有研究发现阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD)、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease,HD)患者脑组织中GLUT1及GLUT3表达量下降,且这种现象发生在临床症状出现之前。另外,一些研究还表明,AD患者脑组织中 GLUT1与 GLUT3的下降与转录因子HIF1-α的下调有关,而HD患者脑组织中伴随着GLUT1、GLUT3的下降还有葡萄糖代谢率的降低和葡萄糖摄取能力的减弱。Kim等研究发现,在散发性克雅氏病(sporadic Creutzfeldt-Jacob disease,sCJD)病人脑组织中大脑皮层的广泛区域葡萄糖代谢率减低,但其相关机制尚无研究报道。本研究拟探究朊病毒感染后 GLUT1和GLUT3蛋白水平和葡萄糖摄取活性的变化及其可能的机制,以期在更深的层次上从能量代谢的角度去认识朊病毒病。
　　目的:
　　检测朊病毒病动物模型(263K或139A感染的仓鼠及139A或ME7感染的小鼠)脑组织及朊病毒感染的细胞模型SMB-S15细胞系中GLUT1和GLUT3蛋白表达情况的变化,并利用2-[氮-7-硝基苯-2-乙二酸,3,4-羟氨基)]-2-脱氧葡萄糖{2-[N-(7-nitrobenze-2-oxa-1,3 diazol-4-yl) amino]-2 deoxy-glucose,2-NDBG}检测SMB-S15细胞葡萄糖摄取能力的变化。另外,检测朊病毒感染动物模型脑组织中转录因子HIF1-α(hypoxia inducible factor-1 alpha)的蛋白水平,以初步探究可能的相关机制。
　　方法:
　　1、分别以正常、263K或139A感染的仓鼠及正常、139A或ME7感染的小鼠脑组织制备脑组织匀浆,并以Western Blot的方法分别检测其中GLUT1、GLUT3的蛋白表达水平;
　　2、进行GLUT3分别与神经元特异性核蛋白(Neuron-specific Nuclear Protein,NeuN)或胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)的免疫荧光双标染色,分别了解它们的共定位情况;
　　3、分别以正常、263K或139A感染的仓鼠及正常、139A或ME7感染的小鼠脑组织制备脑组织石蜡切片,先后用免疫组织化学染色法(Immunohistochemical,IHC)、免疫荧光检测法(Immunofluorescent assay,IFA)检测脑组织切片中GLUT3蛋白的表达情况;
　　4、用 Western Blot和免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)的方法分别检测SMB-S15和SMB-PS细胞系中GLUT1或GLUT3的蛋白表达情况;
　　5、用2-NDBG分别检测SMB-S15和SMB-PS细胞的葡萄糖摄取能力;
　　6、用Western Blot的方法检测朊病毒感染的动物模型脑组织匀浆中转录因子HIF1-α蛋白表达水平的变化。
　　结果:
　　1、与年龄、性别匹配的正常对照组相比,不同朊病毒毒株(263K、139A或 ME7)感染的啮齿动物模型脑组织匀浆中GLUT3蛋白表达量均明显降低(P<0.05),而GLUT1蛋白表达量的变化无统计学差异(P>0.05);
　　2、GLUT3与NeuN有着良好的共定位状态,但与GFAP却没有共定位现象;
　　3、与年龄、性别匹配的正常对照组相比,朊病毒毒株263K、139A或 ME7感染的啮齿动物模型脑组织切片中大脑皮质锥体细胞层和小脑浦肯野细胞层 GLUT3染色阳性细胞数均有所减少,且阳性细胞中GLUT3蛋白信号均明显减弱(P<0.05)。且IFA显示GLUT3阳性信号主要分布在细胞浆中,其次在胞膜上;
　　4、Western Blot与ICC结果均显示:与PS细胞系相比,S15细胞系中GLUT3蛋白的信号明显减弱(P<0.05),而GLUT1蛋白的信号变化无统计学差异(P>0.05);
　　5、用2-NDBG检测SMB-S15细胞和SMB-PS细胞的葡萄糖摄取功能试验结果显示:与PS细胞相比,S15细胞中2-NDBG的绿色荧光信号明显较弱(P<0.05):
　　6、与年龄、性别匹配的正常对照组相比,朊病毒感染的动物模型脑组织匀浆中HIF1-α蛋白信号明显减弱(P<0.05),且随着感染时间延长而不断减弱(P<0.001)。
　　结论:
　　1、朊病毒感染后脑组织、细胞中GLUT3蛋白水平明显下调,而GLUT1蛋白水平无明显变化;
　　2、脑组织中GLUT3主要表达于神经元中,星形胶质细胞中不表达;
　　3、朊病毒感染的动物模型脑组织中存在着神经元的丢失,存活神经元中 GLUT3蛋白表达水平下调。且GLUT3蛋白主要位于神经元胞浆中,其次位于细胞膜上;
　　4、朊病毒持续性感染的SMB-S15细胞系的葡萄糖摄取活性下降,这可能由感染后GLUT3的蛋白表达量下调所致;
　　5、朊病毒感染导致的GLUT3表达下调和葡萄糖摄取活性的下降可能由HIF1-α蛋白水平的下调引起。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1.朊病毒病和朊病毒

1.1朊病毒病

1.2朊病毒

2葡萄糖转运体和神经退行性疾病

2.1葡萄糖是脑组织中的关键供能物质

2.2葡萄糖转运体

2.3神经退行性疾病与葡萄糖转运体表达

正文

1材料

1.1实验标本

1.2主要化学试剂及耗材

1.3分子量标准及试剂盒

1.4主要仪器及设备

1.5常用缓冲液及溶液

2方法

2.1羊瘙痒因子感染的啮齿类动物脑组织样品的制备

2.2 Western Blot

2.3组织切片的免疫荧光染色

2.4石蜡切片的免疫组织化学染色

2.5细胞的复苏、传代及冻存

2.6制备细胞裂解物

2.7 BCA法检测蛋白浓度

2.8免疫细胞化学染色

2.9葡萄糖摄取活性的检测

3结果

3.1 朊病毒感染终末期啮齿动物模型脑组织匀浆中GLUT3的蛋白水平明显降低

3.2 朊病毒感染终末期啮齿动物模型脑组织匀浆中 GLUT1 蛋白水平的变化无统计学差异

3.3 263K感染的仓鼠脑组织匀浆中GLUT3的蛋白水平随着感染时间的延长而不断下降

3.4 GLUT3与NeuN有着良好的共定位状态,但与GFAP无共定位现象

3.5不同毒株感染终末期啮齿动物模型脑组织切片中大脑皮质及小脑中GLUT3阳性细胞数减少,且阳性细胞中的GLUT3信号较正常对照组中的减弱

3.6不同朊病毒毒株感染终末期啮齿动物模型大脑皮质及小脑神经元中GLUT3蛋白主要位于神经元胞浆中

3.7 S15细胞系中GLUT3蛋白表达量较PS细胞中下降而GLUT1的表达量无明显变化

3.8 葡萄糖摄取活性的检测发现S15细胞中的2-NDBG信号较PS细胞中的明显减弱

3.9 朊病毒感染的动物模型脑组织匀浆中 HIF1-α 的蛋白水平随着感染时间的延长而不断下降

4讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢