硫醇转上移酶在皮细胞晚期糖氧化应基化终激中的产物诱表达和导的人作用研晶状体究

摘要

目的：
　　糖尿病持续高血糖状态下，晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）含量相对上升，会诱发氧化应激反应，可能参与糖尿病性白内障的发生发展。硫醇转移酶（Thioltransferase，TTase）作为巯基-二硫化物氧化还原酶家族中的成员，对晶状体氧化还原平衡状态的维持具有非常重要的作用。本实验观察AGEs对人晶状体上皮细胞氧化还原状态和TTase表达的影响，初步研究在AGEs诱导引发的氧化损伤中，TTase可能参与的作用机制，为进一步探究糖尿病性白内障的发病机制提供新思路。
　　方法：
　　1.体外培养人晶状体上皮细胞，实验组采用AGEs-BSA浓度为1.5 mg/ml，10％（v/v）胎牛血清的低糖 DMEM培养液培养；阴性对照组加入相同浓度的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），分别于1 d，2 d，3 d，4 d收集细胞，测定细胞内ROS含量，SOD，CAT活性，并且测定TTase活性，qRT-PCR技术检测TTase mRNA表达，Western blot检测TTase蛋白质的表达情况。
　　2.将前期筛选出来的转染效率较为理想的TTase siRNA转染至人晶状体上皮细胞，测定干扰效率。设立正常对照组，AGEs-BSA组，AGEs-BSA+TTase siRNA阴性对照组和AGEs-BSA+TTase siRNA干扰组，培养2d后测定细胞内ROS含量，SOD活性、CAT活性和GSSG/T-GSH。
　　结果：
　　1. AGEs-BSA处理后细胞内ROS含量随着作用时间延长逐渐增高，测得1 d，2 d，3 d，4 d ROS含量分别为：153.67±24.57，180±11.55，268.01±20.50和313.33±35.46相对荧光单位，较正常对照组明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。测得细胞内CAT活性于1 d，2 d，3 d，4 d时分别为10.07±0.84，9.27±0.72，7.05±0.88和5.30±1.67 U/mg protein，其中2 d，3 d，4 d较正常对照组有明显下降，差异均有统计学意义（P<0.05），SOD活性于1 d，2 d，3 d，4 d分别为104.21±3.95，92.98±8.98，86.54±3.57和81.56±5.06 U/mg protein，较正常对照组有显著性下降（P<0.05），CAT与SOD的活性均随着时间作用延长逐渐下降，BSA对照组与正常对照组无显著差异。
　　2. AGEs-BSA处理后晶状体上皮细胞内TTase mRNA表达水平增高，于2 d时达到峰值，约为正常对照组的5.06倍（P<0.01）。随后表达开始下降，3d时为正常对照组的3.53倍（P<0.01）。4 d时继续下降，为正常对照组的3.10倍。TTase活性1 d，2 d，3 d，4 d分别为8.03±0.86，10.82±0.51，11.05±0.83，8.63±0.77 mU/mg protein，呈先上升后下降的趋势。培养至2 d时，为正常对照组的1.53倍，于3 d时，为正常对照组的1.69倍，均有统计学意义（P<0.05）。BSA处理组TTase活性于1~4 d未见明显变化趋势。AGEs-BSA处理组3 d时TTase蛋白质的表达明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　3. ROS含量测定结果在正常对照组、AGEs-BSA组、AGEs-BSA+TTase siRNA阴性对照组以及 AGEs-BSA+ TTase siRNA干扰组中，分别为93.33±21.85，190.30±9.84，188.02±19.31和280.32±18.35相对荧光单位，AGEs-BSA+TTase siRNA干扰组细胞内ROS含量与AGEs-BSA+TTase siRNA阴性对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。GSSG/T-GSH结果在正常对照组、AGEs-BSA组、AGEs-BSA+TTase siRNA阴性对照组以及 AGEs-BSA+ TTase siRNA干扰组分别为：(3.20±0.47)%，(11.35±0.62)%，(10.86±1.50)%和(16.45±0.64)%，AGEs-BSA+TTase siRNA干扰组细胞内GSSG/T-GSH最高，与AGEs-BSA+TTase siRNA阴性对照组相比有统计学意义（P<0.05）。正常对照组、AGEs-BSA组、AGEs-BSA+TTase siRNA阴性对照组以及 AGEs-BSA+TTase siRNA干扰组的 SOD活性测定结果分别为119.77±8.42，92.98±8.98，79.78±6.05和54.15±9.06 U/mg protein。CAT活性测定结果分别为15.07±0.78，9.27±0.73，9.01±1.52和4.01±0.94 U/mg protein，AGEs-BSA+TTase siRNA干扰组细胞SOD和CAT活性与AGEs-BSA+TTase siRNA阴性对照组比较显著降低（P<0.05）。
　　结论：
　　AGEs影响人晶状体上皮细胞的氧化还原状态，增加ROS水平，使抗氧化酶SOD和CAT部分失活。然而在AGEs作用初期，TTase表达与活性增强，参与细胞早期的抗氧化损伤作用，其机制可能为修复SOD和CAT活性，降低GSSG/T-GSH，ROS含量，从而参与调节细胞氧化还原状态的平衡。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、 糖尿病性白内障的发病机制

二、 晚期糖基化终产物

三、晶状体的氧化还原平衡

四、Grx研究进展

引言

1 材料

1.1 细胞

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂

1.4 主要溶液配制

2 方法

2.1 人晶状体上皮细胞的体外培养

2.2 人晶状体上皮细胞的分组和处理

2.3 TTase 表达和活性的测定

2.4 TTase siRNA的转染和干扰效率的评价

2.5 相关生化指标的测定

2.6 统计学分析方法

3 结果

3.1 AGEs-BSA对人晶状体上皮细胞氧化状态的影响

3.2 AGEs-BSA作用不同时间对人晶状体上皮细胞TTase的影响

3.3 TTase在AGEs-BSA诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激中的作用

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢