维生素K2逆转华法令诱导大鼠主动脉钙化及其机制研究

摘要

动脉钙化（Arterial Calcification，AC）是糖尿病（Type2 Diabetes，TD2）、慢性肾病（Chronic Kidney Disease，CKD）和慢性炎症性疾病中普遍存在的血管病变，也是导致原发病病情恶化、死亡率增加的高危因素之一。并与TD2和尿毒症患者血管弹性受损、冠心病支架术后再狭窄等并发症密切相关，同样与心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）的发病率和死亡率高度相关。血管钙化不仅表现相应的临床症状，治疗不及时还会引发各种血管性疾病。而血管钙化性疾病则会引发钙化性主动脉瓣疾病、尿毒症以及慢性炎症等，增加CVD的危险性。因此，血管钙化的预防和治疗对于原发病的进展和预后具有重要临床意义。
　　迄今为止，临床上针对AC仍然缺乏有效的治疗手段。过去10年的研究发现骨调节蛋白参与了血管钙化的刺激和抑制，其中维生素K（Vitamin K，VK）依赖蛋白基质Gla蛋白（Matrix Gla Protein，MGP）是体内最强的AC抑制剂之一。MGP活化后通过抑制血管壁内钙的过饱和及钙盐的沉积，抑制血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cell，VSMC）向成骨样细胞分化，发挥抗血管钙化的作用。而VSMC向成骨样细胞分化是 AC的关键环节和细胞学基础。但是，VSMC钙化的分子机制仍有待进一步阐明。
　　VK依赖蛋白生长抑制特异蛋白6（Growth Arrest-Specific Protein6，Gas6）激活后能够抑制凋亡表达并促进VSMC向血管损伤部位迁移。但是在AC的抑制中Gas6的含量以及角色如何尚不得而知。因此，我们提出以下问题：①华法令（Warfarin，WFN）诱导大鼠体内动脉钙沉积含量呈高表达状态，高剂量VK2干预后能抑制甚至逆转已形成的钙化吗？②在钙化发生、发展中VSMC发生氧化应激损伤，进而向成骨样细胞分化，最终促进细胞凋亡引发钙化形成，高剂量 VK2是否影响了上述生物学反应，并通过调控凋亡的发生而影响钙化形成？③钙化大鼠主动脉组织中Gas6及其下游信号通路中蛋白激酶B（Protein Kinase B，Akt）以及抗凋亡蛋白（Astiapoptotic Proteins）B细胞淋巴瘤/白血病-2（B-Cell Leukemia-2，Bcl-2）的表达水平如何？VK2干预后能通过Gas6介导的Akt凋亡信号通路抑制凋亡从而抑制钙化形成吗？以上问题都需要进一步深入研究。
　　目的:
　　（1）构建AC模型，明确WFN诱导大鼠主动脉钙化时VK2逆转钙化形成情况。
　　（2）观察钙化大鼠主动脉组织中活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的表达、血清碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）活性以及VSMC凋亡表达的变化过程，分析钙化的影响以及与凋亡的相关性。
　　（3）明确Gas6、Axl、p-Akt、Bcl-2蛋白在WFN诱导大鼠主动脉钙化时的表达变化，探讨WFN诱导大鼠主动脉钙化时VK2逆转钙化形成的机制。
　　方法:
　　（1）选用10 W SD雄性大鼠。用含WFN（3 mg/g饲料）和VK1（1.5 mg/g饲料）的饲料饲养6 W，建立AC模型。在此基础上，给予含VK2（100μg/g饲料）的饲料继续喂养6W干预钙化。
　　（2）将大鼠随机分成5组：对照组（0 W、6 W、12 W）、6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组及6 W钙化+6 W VK2组，检测各组钙化形成、ROS水平、ALP活性、凋亡表达和Gas6、Axl、p-Akt、Bcl-2蛋白表达水平。
　　（3）邻甲酚肽络合酮比色法检测大鼠主动脉钙沉积含量。Von Kossa和茜素红染色验证钙化表达。
　　（4）冰冻组织切片检测各组大鼠主动脉组织ROS表达。
　　（5）心脏（右心室）取血检测ALP活性。
　　（6）采用TUNEL与DAPI免疫荧光双标法，应用激光共聚焦显微镜观察各组大鼠主动脉组织VSMC凋亡情况。
　　（7）应用透射电子显微镜观察各组线粒体形态改变。
　　（8）通过蛋白免疫印迹法（Western Blotting）检测大鼠主动脉组织Gas6、Axl、t-Akt、p-Akt及Bcl-2蛋白表达水平。
　　结果:
　　（1）WFN干预12 W期间动脉中钙沉积含量呈线性增长（P<0.01）；6 W钙化+6 W VK2组与6 W钙化组相比钙沉积含量减少39％，与12 W钙化组相比钙沉积含量减少60%；6 W钙化+6 W VK2组治疗AC（7–12 W）约44%的预成型钙盐被移除（P<0.01）。
　　（2）6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W VK2组、6 W钙化+6 W Normal组较对照组主动脉组织ROS表达显著增加（P<0.01），6 W钙化+6 W VK2组与6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组比较主动脉组织ROS表达显著降低（P<0.01）。
　　（3）4 W钙化组、6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组较对照组ALP活性明显增加（P<0.01），6 W钙化+6 W VK2组与4 W钙化组、6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组比较ALP活性明显降低（P<0.01）。
　　（4）6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组较对照组细胞凋亡表达明显增加（P<0.01），6 W钙化+6 W VK2组较6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组细胞凋亡表达明显减少（P<0.01）。Pearson相关性分析凋亡表达与钙化形成具有显著相关性，相关系数R2=0.8853，（P<0.0001）。
　　（5）透射电子显微镜观察对照组线粒体包膜完整，嵴清晰可见。各钙化组线粒体肿胀并部分溶解，线粒体嵴减少或部分消失；VK2治疗后线粒体肿胀和溶解减轻、线粒体嵴减少或消失部分减轻。
　　（6）6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组较对照组组织Gas6、Axl、p-Akt、Bcl-2蛋白表达明显降低（P<0.01）；6 W钙化+6 W VK2组与6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组比较部分恢复了组织中Gas6、Axl、p-Akt、Bcl-2蛋白表达（P<0.01）。
　　结论:
　　高剂量VK2对WFN诱导的大鼠主动脉钙化有逆转作用。研究显示VK2通过上调VSMC Gas6-Axl的表达，激活Akt磷酸化，促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而抑制WFN诱导的大鼠主动脉组织VSMC的凋亡表达和钙化形成。明确了Gas6及其下游Axl-Akt-Bcl-2抗凋亡信号通路，可显著提升VSMC的活性及迁移能力，减少凋亡表达，进而有效抑制和/或逆转AC损伤，为解决AC损伤的治疗提供理论依据。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1. 动脉钙化的流行病学研究

2. 动脉钙化的发病机制研究

3. 动脉钙化的治疗研究进展

4. 维生素K与动脉钙化

5. 生长抑制特异蛋白6（Gas6）

6. 研究假设

第一部分 维生素K2逆转华法令诱导大鼠主动脉钙化

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二部分 维生素K2逆转华法令诱导大鼠主动脉钙化机制研究

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

全文研究结论

参考文献

个人简历和研究成果

致谢