GFP-α-tubulin/GFP-CENP-A-HeLa细胞系的建立及其功能评价

摘要

肿瘤作为慢性非传染疾病已成为危害人类健康并导致死亡的头号杀手，世卫组织发布的最新癌症报告显示恶性肿瘤发病率与死亡率依然呈现迅猛增长的趋势。因此从细胞分子水平研究肿瘤的发生机制，为肿瘤的治疗及预防奠定基础有着迫切的需要。随着近年来分子影像学的发展，高分辨高速的活细胞成像显微镜系统日益成熟，这就为从细胞层面动态研究肿瘤的发生发展机制提供了强有力的工具。而如何应用该技术，达到筛查治疗肿瘤有效化学药物的目标，迫切需要构建一种能够反映化疗药物是否损伤肿瘤细胞的、稳定表达微管和着丝粒相关蛋白质的荧光报告细胞系模型，通过观察肿瘤细胞的行为变化，为肿瘤的治疗提供有效的化疗药物筛查的工具。
　　细胞周期的错误调节可以导致肿瘤的发生。细胞周期中的有丝分裂过程是一个精细调节的过程，其中每一对染色体都需要正确的连接来自于两极的微管，如果着丝粒与微管的附着错误就会导致染色体的排列错误，进而导致染色体分离的异常，促进染色体不稳定性的发生，最终产生非整倍体的细胞，导致肿瘤的发生。为了更直观的精确研究染色体与微管的运动结合过程，预期构建标记GFP绿色荧光蛋白质的微管和着丝粒相关蛋白质的肿瘤细胞系，从而利用活细胞显微工作站来研究不同的化疗药物损伤肿瘤细胞的机制，为进一步研究肿瘤发生及筛查肿瘤化疗药物奠定基础。
　　目的：
　　1.应用慢病毒转染技术，构建稳定表达 GFP绿色荧光蛋白质的微管和着丝粒相关蛋白质的肿瘤细胞模型。
　　2.应用GFP-α-tubulin/GFP-CENP-A-HeLa细胞模型，观察细胞周期变化，来评价微管相关化疗药效果及机制。
　　方法：
　　1.分子克隆构建慢病毒相关质粒，并转入293T细胞中收集上清最终获得可用于感染的慢病毒。
　　2.利用胸苷阻滞的细胞同步化方法获得G1期阻滞的细胞，释放后进入有丝分裂期前进行活细胞动态观察。
　　3.利用实时动态活细胞工作站来动态观察细胞有丝分裂的进程。
　　4.将细胞中加入Nocodazole及 Taxol化疗药，观察微管动态变化及细胞凋亡的进程。
　　结果：
　　1.通过分子克隆技术成功将表达CENP-A/α-tubulin片段插入到表达GFP的慢病毒载体中。利用293T细胞产生慢病毒并最终成功获得表达GFP-CENP-A/α-tubulin的HeLa细胞系。
　　2.通过激光共聚焦显微镜观察到在间期细胞中，存在微管结构绿色荧光表达，提示该细胞系可用于活细胞观察。
　　3.建立了基于HeLa细胞系的化学药物同步化方法，成功地将HeLa细胞周期阻滞于G1期，并通过释放得到了处于G1/S,S,G2/M各个周期的细胞，为活细胞观察奠定基础。
　　4.利用Time-Lapse活细胞工作站，对表达GFP-CENP-A/α-tubulin的HeLa细胞系进行同步化后在有丝分裂期进行动态观察，成功地观察到了微管与着丝粒的动态变化过程。
　　5.通过比较GFP-CENP-A/α-tubulin的HeLa细胞与正常细胞的有丝分裂进程，提示两者在细胞分裂时间上并无显著性差别，提示该细胞的细胞周期是正常的，因此可用于进一步的功能评价。
　　6.利用Time-Lapse活细胞工作站动态观察了解聚药加入及撤离细胞后，微管的重新生长过程，此结果表明GFP-CENP-A/α-tubulin已经稳定整合于HeLa细胞基因组中，提示该细胞可以作为开展针对微管的化疗药作用机制研究的强大工具。
　　结论：
　　成功构建了慢病毒转染稳定表达标记绿色荧光蛋白质的着丝粒(GFP-CENP-A)与微管(GFP-α-tub ulin)的He La细胞模型；该细胞系模型可用来有效评价微管相关药物对肿瘤细胞微管功能的影响，为研究微管与着丝粒的附着以及肿瘤治疗提供了有效的工具。

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封面

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

有丝分裂的进程

着丝粒的分子构成

着丝粒的组装

微管与着丝粒连接

染色体向中期排列的机制

微管-着丝粒附着错误的纠正

纺锤体检查点调控：连接与拉力

微管附着错误与肿瘤发生

实验一 分子克隆构建慢病毒转染质粒，获得慢病毒并感染得到靶细胞

1材料

2方法和结果

3讨论

实验二 同步化监测细胞周期进程，并观察微管与着丝粒的动态附着过程

1材料

2方法与结果

3 讨论

实验三 对稳定表达GFP-α-tubulin/GFP-CENP-A的He La细胞系功能评价

1材料

2 方法与结果

3 讨 论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢