禾谷镰刀菌甾醇14α-脱甲基酶(CYP51)与三唑类杀菌剂互作研究

摘要

由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是全球性的麦类真菌性病害，不仅降低产量造成巨大的经济损失，另外，染病麦粒中所含有的真菌毒素对人畜健康安全产生了严重的威胁。目前，生产上对于小麦赤霉病的防治主要依靠化学药剂防治，早期苯并咪唑类杀菌剂使用较为广泛，但由于作用位点较单一，在田间出现了较为严重的抗药性现象。近年来在生产上，三唑类药剂（戊唑醇，三唑酮）逐渐替代苯并咪唑类杀菌剂成为防治小麦赤霉病的主要杀菌剂，效果较好。该类杀菌剂主要作用于甾醇生物合成中的14α-脱甲基酶（CYP51），使真菌麦角甾醇的合成受阻，从而破坏细胞膜功能，起到杀菌的功能。
　　本研究旨在探究禾谷镰刀菌CYP51蛋白与三唑类杀菌剂精细互作，明确禾谷镰刀菌对三唑类杀菌剂潜在的抗性风险与机制。主要研究结果如下：
　　1．利用原核表达系统对禾谷镰刀菌3个CYP51蛋白进行表达，结果显示禾谷镰刀菌CYP51B全长蛋白在大肠杆菌表达系统中不表达，截去跨膜区域后，蛋白成功表达，但是大部分蛋白主要以不可溶的包涵体存在，其中少量可溶蛋白极不稳定；利用结合光谱法测定重组表达的 FgCYP51B蛋白与戊唑醇、三唑酮的体外结合能力，但未能检测到450 nm处的吸收峰；CYP51A全长以及截去跨膜区域后的截短体蛋白均以包涵体的形式存在；CYP51C全长蛋白在大肠杆菌中表达，但不可溶。
　　2．通过基因定点突变将禾谷镰刀菌CYP51B蛋白第123和137位氨基酸由酪氨酸突变为组氨酸，并获得转化子，测定了突变体对戊唑醇、丙环唑和三唑酮的敏感性。其中，Y137H突变体对戊唑醇的敏感性降低，出现抗性现象；分子对接同时证明了野生型FgCYP51B蛋白比突变体的FgCYP51B（Y137H）与戊唑醇有更高的亲和力。
　　3．实验采用菌丝生长速率法测定了禾谷镰刀菌ΔFgCYP51A菌株对五种三唑类杀菌剂的EC50值，ΔFgCYP51A菌株对丙环唑、戊唑醇、烯唑醇、三唑醇和三唑酮的EC50值分别为0.024 mg/L，0.012 mg/L，0.148 mg/L，0.154 mg/L和0.474 mg/L。FgCYP51A基因敲除后，菌株对戊唑醇、三唑醇、三唑酮和丙环唑的敏感性均显著增加，而烯唑醇无明显变化。

目录

声明

英文缩写词表

第一章 绪论

1 小麦赤霉病研究概况

2甾醇14α-脱甲基酶（CYP51）

3 唑类杀菌剂抗药性研究

4 研究目的与意义

第二章 禾谷镰刀菌CYP51蛋白的原核表达与纯化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第三章 禾谷镰刀菌CYP51B蛋白定点突变对三唑类杀菌剂敏感性的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3结论与讨论

第四章 五种三唑类杀菌剂对禾谷镰刀菌CYP51A基因敲除菌株的敏感性研究

1 材料与方法

2结果与分析

3结论与讨论

第五章 全文结论

第六章 工作展望

参考文献

致谢

作者简历

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