酶类与非酶类天然提取物抗氧化性研究

摘要

生物体内存在的过量氧自由基与蛋白质、脂类化合物、多糖、核酸等大分子发生氧化反应造成对细胞损伤和引起组织结构的非正常变化,进而引发心血管疾病、衰老甚至癌变等问题。抗氧化性物质可淬灭自由基,阻止因过量自由基和生物大分子作用发生的一系列链式氧化过程。尽管通过化学手段合成的物质如叔丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、没食子酸丙脂(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)等具有优良的抗氧化性质,且在食品及其它领域已经得到广泛应用,但近年研究发现,这类物质对人体呼吸酶活性产生一定不利影响,有的甚至还有致畸作用,一旦通过各种途径进入人体会产生潜在危害。因而寻找安全、可靠的抗氧化物质的成为近年世界各国精细化工领域研究的重点内容之一。
　　许多物种尤其是食品类植物资源中均不同程度地含有一定量的抗氧化性物质,通过科学提取可得到比化学法所合成的抗氧化物质相对更为安全和可靠的天然抗氧化活性物质。然而,提取的天然抗氧化性物质是一种混合物,其抗氧化效果往往弱于合成物,热稳定性也较差,尤其是提取物中的超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、过氧化物酶(Peroxidase, POD)等,由于它们都是蛋白酶,对环境要求比较苛刻,从而影响抗氧化活性和稳定性以及储存的时间,使天然抗氧化物的应用受到一定限制。
　　鉴于这些缺点,本实验除对提取抗氧化活性物质的方法进行了系统研究之外,还考察了某些效应物存在对抗氧化物酶的影响以及人体所需的微量金属元素同所提取的非酶天然提取物的抗氧化活性之间的协同作用,选择出了稳定性高、抗氧化性较强的“复合型抗氧化物”。实验选用资源比较丰富的茄科植物茄茎、枸杞、辣椒为原料,采用索氏提取、浸渍和超声波等方法提取非酶抗氧化性物质,用盐析法、有机溶剂沉淀法及超滤法分级分离等手段提取抗氧化物酶,确定出最佳提取方法、条件,用统计学原理分析实验结果是否存在差异性显著及可靠性,同时对不同提取物和加入一定效应物后的抗氧化性进行评价,考察了效应物金属离子、VC、VE和一些有机物对抗氧化提取物热稳定性和储存稳定性产生的影响,为开发安全可靠的天然复合型抗氧化性物提供科学指导和帮助。
　　主要结论如下:(1)以过氧化值(POV)为评价指标选择了非酶提取物最佳提取条件:对于辣椒非酶提取物,以85％乙醇为溶剂,采用超声波法超声30 min得到的提取物抗油脂能力最强;对于枸杞非酶提取物,先以60％乙醇为溶剂,通过超声波法超声40 min,在pH为1-2的水溶液条件下水解3h后效果最好;对茄茎非酶提取物,用60％乙醇为溶剂,采用浸渍法提取。提取方法同样影响酶类提取物的提取条件:体积为原料二倍的水为溶剂超声波(40kHz)法低温下超声30 min得到酶的初提物,再经过硫酸铵分级分离、超滤精制后的抗氧化物酶SOD;对抗氧化物酶POD,除进行硫酸铵分级分离和超滤外,还需经过使用丙酮进行分级分离;和对照组对提取方法进行t-检验,差异性显著。选择原料实验表明:以辣椒为原料提取POD和以枸杞为原料提取SOD。
　　(2)不同原料得到的提取物抗氧化性能在不同评价指标中因作用机理不同表现出不同的抗氧化性。茄茎非酶提取物对DPPH-有很强的清除能力,其抗油脂氧化性比VC、柠檬酸和VE强,但比BHT的差;辣椒非酶提取物在抗p-胡萝卜素氧化能力、清除超氧阴离子自由基能力和抗油脂氧化能力方面均比BHT强,但在对DPPH-清除能力方面表现较弱;枸杞非酶提取物在抗p-胡萝卜素氧化能力方面和BHT相当,在对DPPH-清除能力方面表现具有较强的作用。辣椒酶提取物的POD在温度为60℃,pH为5时活力最大,平均活力为16.77 u/g,通过Dalziel和Alberty方程对POD催化的反应进行了数据拟合,证明POD酶催化反应为有序反应;枸杞提取物的SOD在45℃、pH为6.5时活力最大,平均活力为171.8 u/mL。
　　(3)采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对非酶提取物活性成分测定结果表明:茄茎提取物主要成份有棕榈酸、苯乙胺、苯甲酸、邻苯二甲酸二丁酯等芳香族和有机酸类化合物以及少量酚类化合物;辣椒提取物主要含辣椒素、2,4-癸二烯醛,9,12-十八碳二烯酸,辣椒碱,苯乙酸,4-羟基-3-甲基酚等酚类、脂肪酸等化合物;枸杞非酶提取物主要有氧化萜类、脂肪酸脂类、醛酮类、芳香族化合物。非酶提取物中总酚含量与其产率之间的没有显示出相关性(r2=0.1813),与POV值之间线性相关性也较差(r2=0.492)。但和DPPH-抑制率以及p-胡萝卜素脱色率之间存在较强的线性相关,其相关系数分别为r2=0.9927和r2=0.9855,t-检验也证实结果间差异性显著。
　　(4)提取物与效应物协同实验表明:添加不同效应物,表现出的效果差别较大。非酶提取物和Vc按1:1混合,其抗氧化性优于合成抗氧化剂BHT;微量金属离子的存在对非酶提取物抗油脂氧化能力、清除O2-·和DPPH·能力、抗p-胡萝卜素氧化率等均有一定程度的影响;其中以Se(Ⅳ)在辣椒和枸杞非酶提取物中的存在均能显著提高提取物的抗氧化能力,表现出明显增效作用,说明二者存在一定的协同关系;当Fe2+和Mn2+浓度分别为800 mg/L和500 mg/L时,枸杞非酶提取物对O2-·自由基清除率可分别提高55％和40％,辣椒非酶提取物对O2-.自由基清除率可分别提高81％和79％。相同效应物对辣椒POD和枸杞SOD活力影响不同。KCl、NaCl、CaCl2、ZnSO4、MgSO4、乙酸锌、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸锰、乙二醇、丙三醇、D-甘露醇和D-山梨醇对POD为激活剂,CuCl2、柠檬酸对POD为抑制剂,对活力影响符合“S”型曲线规律。浓度为2.0 m mol/L、混合比例为1:1的乙酸锌和D-山梨醇组成的二元效应物可提高80％的POD活力。乙二醇、丙三醇和D-山梨醇对SOD为激活剂,KCl、NaCl、CaCl2、ZnSO4、MgCl2、乙酸锌、葡萄糖酸锌和葡萄糖酸锰为抑制剂,对活力影响符合“双曲线”型规律,利用双倒数法确定出葡萄糖酸锌、乙酸锌、Ca2+、Mg2+属于竞争性抑制剂,而K+、Na+、Mn2+、Cu2+、ZnSO4属于反竞争抑制剂。
　　(5)建立了辣椒和枸杞非酶提取物失活速率方程,得到非酶提取物在效应物亚硒酸钠存在情况下失活反应活化能变低,稳定性减弱。对辣椒非酶提取物,其失活速率k=1.42×102.e(?),r2=0.99;加入亚硒酸钠效应物后的反应速率k=0.167.e(?),r2=0.958,活化能降低了53.8％。对枸杞非酶提取物,失活速率符合方程k=1.519.e(?),r2=0.908;加入亚硒酸钠效应物后,反应速率k=1.669×10-2·e(?),r2=0.981,活化能也变小。对于辣椒POD,失活速率符合k=1.36×109e(?),r2=0.960,加入效应物后,失活速率符合k=3.406×108e(?),r2=0.967,加入效应物后POD失活反应的活化能增大;对于枸杞SOD,k=3.612×103e(?),r2=0.972,加入效应物后,k=2.355×104e(?),r2=0.904,活化能亦增加。计算表明,在室温4℃下辣椒POD的抗氧化活性损失是25℃时活性的十分之一,枸杞SOD在4℃时的活性损失是25℃时的四分之一,加入效应物后可使半衰期延长一倍。
　　(6)研究了POD和SOD的微电泳行为和POD电化学稳定性的规律。结果表明,在pH为2-9的范围,POD和SOD均带负电荷;未加入效应物前颗粒之间相互吸引作用较强,团聚作用明显,颗粒尺寸分布宽,平均粒径较大;加入效应物后颗粒尺寸分布变窄,平均粒径较小。POD的等电点(pI)约等于5.19,SOD的pI值约等于5.1;加入效应物后的POD和SOD的pI位移量大,保持较高的稳定性;用纤维素包埋法将效应物-辣椒过氧化物酶-纤维素/多壁碳/Pt的复合物修饰在Pt片电极表面,制备成的修饰电极稳定性良好,得到的循环伏安曲线峰形最好,峰电流大。

目录

摘要

ABSTRACT

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第一章 文献综述与选题

1.1 抗氧化性物质

1.1.1 合成抗氧化物

1.1.2 天然抗氧化物

1.2 抗氧化物提取方法

1.2.1 非酶类抗氧化物提取方法

1.2.2 酶类抗氧化物提取方法

1.3 抗氧化物的抗氧化机理

1.4 效应物与抗氧化物的协同作用

1.5 抗氧化能力评价

1.5.1 非酶类抗氧化物评价方法

1.5.2 酶类抗氧化物活力测定方法

1.6 国内外研究状况及资源状况

1.7 立题意义和实验内容

1.7.1 立题的目的意义

1.7.2 实验内容

参考文献

第二章 实验仪器与方法

2.1 实验仪器、试剂、材料

2.1.1 仪器

2.1.2 药品

2.1.3 材料

2.2 实验内容

2.2.1 非酶类抗氧化物的提取

2.2.2 酶类抗氧化物的提取

2.2.3 POV的测定

2.2.4 β-胡萝卜素漂白法

2.2.5 DPPH·的抑制

2.2.6 O_2~-·的清除

2.2.7 SOD活力测定

2.2.8 POD活力测定

2.2.9 总酚含量测定

2.2.10 酶浓度测定

2.2.11 GC/MS分析

2.2.12 Zeta电位测定

2.2.13 过氧化物酶电化学稳定性的测定

参考文献

第三章 酶类与非酶类提取物提取条件选择

3.1 非酶类提取物提取方法选择

3.1.1 溶剂和提取方法对提取率影响

3.1.2 溶剂和提取方法对POV影响

3.2 酶类提取物提取方法选择

3.2.1 选择初提方法

3.2.2 选择纯化方法

3.2.3 验证试验

3.2.4 原料的选择

3.3 本章小结

参考文献

第四章 非酶类提取物抗氧化活性评价及协同效应研究

4.1 非酶类提取物抗氧化性活性

4.1.1 非酶类提取物抗油脂氧化能力

4.1.2 非酶类提取物对β-胡萝卜素抗氧化率影响

4.1.3 非酶类提取物对DPPH·抑制率

4.1.4 非酶类提取物对O_2~-·清除率

4.2 非酶提取物成分分析

4.3 总酚含量与抗氧化活性相关性

4.4 效应物对非酶提取物抗氧化活性协同效果

4.4.1 维生素

4.4.2 金属离子

4.5 本章小结

参考文献

第五章 影响酶类提取物活力因素及协同效应研究

5.1 POD活力影响因素

5.1.1 温度的影响

5.1.2 酸度的影响

5.1.3 愈创木酚浓度的影响

5.1.4 过氧化氢浓度的影响

5.2 效应物对POD活力的协同效应

5.2.1 一元效应物的影响

5.2.2 二元效应物的影响

5.3 SOD活力影响因素

5.3.1 温度的影响

5.3.2 酸度的影响

5.4 效应物对SOD活力的协同效应

5.5 本章小结

参考文献

第六章 酶类与非酶类提取物抗氧化稳定性研究

6.1 非酶类提取物抗氧化稳定性的研究

6.1.1 辣椒非酶提取物抗氧化稳定性

6.1.2 枸杞非酶提取物抗氧化稳定性

6.2 酶类提取物抗氧化稳定性研究

6.2.1 辣椒POD稳定性

6.2.2 枸杞SOD稳定性

6.2.3 辣椒POD酶电化学稳定性

6.3 本章小结

参考文献

第七章 主要结论和建议

7.1 结论

7.2 创新点

7.3 不足与建议

博士期间发表论文及成果

致谢