一、β淀粉样蛋白31-35片段对海马CA1神经元BK通道和[Ca2+]i的影响：全细胞膜片钳和离子荧光成像技术观察;二、Humanin对Aβ31-35抑制大鼠海马神经元BK电流及升高[Ca2+]i作用的观察;三、Ⅰ型代谢型谷氨酸受体参与脊髓痛信号传递作用的观察

摘要

本研究分为三部分： 第一部分：β淀粉样蛋白31-35片段对海马CAl神经元BK通道和[Ca<'2+>]<,i>的影响：全细胞膜片钳和离子荧光成像技术观察 阿尔采末病(Alzheimer's disease，AD)是一种不可逆的中枢神经系统的退行性疾病。主要临床表现为进行性学习、记忆和认知能力的减退；主要病理特征为新皮层、海马出现高密度老年斑(SP)，神经纤维缠结(NFTs)和大量神经元的丢失等。β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)是构成老年斑的重要成分。 关于Aβ及其片段的神经毒作用的机制仍未彻底明了。已有研究报道，它们除了能引起Ca<'2+>超载、氧化应激等毒性作用外，对细胞膜上离子通道活动的影响引起了人们的广泛兴趣。 本研究拟采用全细胞膜片钳记录技术，在急性分离的大鼠海马CA1神经元上观察Aβ31-35对全细胞BK电流的影响；并采用Ca<'2+>荧光成像技术(Ca<'2+>nuorescence imaging)，观察Aβ31-35对海马神经元的[Ca<'2+>]<,i>的影响，以期对Aβ31-35神经毒性作用作更深入的探讨。 膜片钳及胞内钙浓度测定结果显示，1)利用全细胞膜片钳记录技术结合通道阻断剂及无Ca<'2+>液灌流后可记录到神经元的BK电流(瞬变外向电流)；2)Aβ31-35可通过抑制BK通道而降低BK电流；3)Aβ31-35可引起海马CA1神经元的[Ca<'2+>]<,i>升高而引发钙超载；4)由于5μM的Aβ31-35 R抑制BK电流而不影响[Ca<'2+>]<,i>，推测Aβ31-35对海马神经元[Ca<'2+>]<,i>及BK通道的影响可能是通过不同的途径发挥作用。 第二部：分Humanin对Ap31—35抑制大鼠海马神经元BK电流及升高[C8<'2+<]<,i>作用的观察 Humanin(HN)是新近发现的由24个氨基酸组成的线性多肽，能有效抑制由多种FAD基因突变和A β衍生物诱发的神经毒作用，如抑制由A β1-42和A β 25-35引起的大脑皮层培养神经元死亡等。本实验拟采用全细胞膜片钳技术记录大电导Ca<'2+>激活K<'+>通道(BK)电流及电压门控Ca<'2+>电流，以及利用激光共聚焦技术，观察HN对A β 31-35抑制大鼠海马神经元BK电流及升高[Ca<'2+>]<,i>作用的影响，并对HN神经保护作用的机制进行进一步探讨。 结果显示：在只含有A β 31-35的灌流液中记录到的BK电流的最大峰值由对照的3303.67±332.7pA减少为2715.12±82.99pA，减少率为17.3％±6.8％(P<0.005，n=5);在此基础上加入HN进行记录时发现，记录到的BK电流最大峰值进一步减少为2225.54±254.29pA，较单独使用A β 31-35时BK电流幅度更低，与对照组相比，减少率为32.7％±2.0％(P<0.001)，与单独使用Aβ 31-35相比，减少率为18.2％±7.7％(P<0.005)。 鉴于上述出乎意料的结果，观察了单独应用HN对海马CA1神经元BK电流的作用。在0mV的膜电位时，BK电流的峰值从对照组的1405.97±350.87pA减少为加入HN(5 μ M)后的999.74±247.72pA，减少率为28.4％±10.4％(P<0.05，n=7)。 HN对海马CA1神经元电压门控Ca<'2+>通道的作用。 利用全细胞膜片钳技术，观察了HN对海马CA1神经元的电压门控Ca<'2+>通道的作用。在全细胞电压钳记录的条件下，给予细胞由-60～+50 mV(以10 mV递增)的阶跃去极化刺激，可记录到快速的内向电流(浸浴液中含有TTX阻断Na<'+>通道)，最大峰值出现在0 mV。浸浴液中加入HN(5 μ M)后，Ca<'2+>电流的峰值(0mV膜电位)由-622.3±118.13 pA减少为-467.4±112.28 pA，减少率为25.2％±6.9％，两者具有显著性差异(P<0.05，n=7)。 综上所述，可得出如下结论：1)A β具有升高[Ca<'2+>]；和抑制BK电流的作用；2)A β诱发的Ca<'2+>超载是Aβ产生细胞毒作用的重要原因；3)HN通过抑制L-型钙通道而减弱A β诱发的Ca<'2+>超载，可能是HN拮抗Aβ神经毒发挥保护作用的重要机制；4)L-型钙通道可能是HN和Aβ的共同靶点；5)由于观察到单独应用HN产生了对BK电流和Ca<'2+>电流的抑制作用，由此推测HN对BK的作用可能是通过HN抑制Ca<'2+>通道降低[Ca<'2+>]<,i>，由此产生的对BK电流的抑制，而不是HN对BK通道的直接抑制作用。 第三部分：I型代谢型谷氨酸受体参与脊髓背角痛信号传递作用的观察 近年的研究认为，兴奋性氨基酸在脊髓水平痛信号传递过程中发挥非常重要的作用。谷氨酸受体一般分为两大类：离子型受体(iGluRs)和代谢型受体(mGluRs)。过去的研究大多集中于iGluRs在脊髓水平参与伤害性信息的处理和传递过程。但在新近研究中，mGluRs在外周和中枢信息传递过程中的作用越来越受到重视。本实验用福尔马林注入引起的慢性痛模型，通过脊髓背角Fos蛋白检测与痛行为反应测定，观察了脊髓水平Ⅰ型mGluRs，包括mGluRl和mGluR5在脊髓痛信息处理和传递中所起的作用。 实验中选取21只SD大鼠，随机分为3组，两个实验组大鼠预先鞘内分别注入mGluR<,1>和mGluR<,5>的特异拮抗剂CPCCOEt和MPEP，一个对照组只在鞘内注入等量的药物溶剂；10分钟后在三组大鼠均在一侧后脚掌注入福尔马林(5％，50μl)，随即进行1h的行为痛反应观察，之后立即灌注固定处死动物，用免疫组化技术检测脊髓背角Fos免疫阳性神经元(FLI)的数目。结果显示：1.鞘内分别注射CPCCOEt和MPEP后，大鼠行为痛反应的第二相较对照组均减弱约50％(每组n=7；CPCCOEt组，P<0.05；MPEP组，P<0.01)，而第一相痛行为反应在两个鞘内给药组和对照组间无显著变化；2.分别检测三组动物福尔马林注射侧脊髓背角中的Fos免疫阳性神经元(FLI)数目，与对照组相比，CPCCOEt和MPEP注射组分别由对照组的154.9±21.4降低到101.5±21.8(CPCCOEt组，P<0.05)和98.3±17.0(MPEP组，P<0.01)，降幅约30％左右。 上述结果表明：1.mGluR<,1>和mGluR<,5>在脊髓背角均参与痛信息的感受和传递；2.根据行为痛反应观察，mGluR<,1>和mGluR<,5>只参与福尔马林所致的第二相的痛信息的传递，即参与了慢性痛而不参与急性痛的传入；3.由于痛行为检测存在主观因素影响，它所显示的Ⅰ型mGluRs在脊髓痛传递中的参与程度可能较实际为大，免疫组化检测结果可能更接近于实际；4.mGluR<,1>和mGluR<,5>除了通过目前公认的突触后机制实现其促进脊髓痛信号的感受和传递外，也不能排除存在突触前机制，即通过传入末梢上自身受体的正反馈作用促进第一级传入末梢的递质释放，从而增强痛信号在中枢的传递。

目录

Abstract

PartⅠ Effects of amyloid β-protein fragment 31-35 on BK channels and [Ca2+]i of hippocampal CA1 neurons:observation by whole cell clamping and ion fluorescence imaging techniques

Introduction

Materials and Methods

Results

Discussion

References

PartⅡ Humanin，a novel rescue factor，affects Aβ31-35-triggered suppression of BK currents and elevation of [Ca2+]i

Introduction

Materials and Methods

Results

Discussion

References

PartⅢ Group Ⅰ metabotropic glutamate receptors facilitate neuronal excitability synaptic transmission of nociceptive inputs at the spinal level in rats

Introduction

Materials and Methods

Results

Discussion

References

综述

致谢