CD4CD25调节性T细胞α7烟碱型乙酰胆碱受体的表达及其在T淋巴细胞免疫抑制功能中地位的研究

摘要

目的：α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAchR)在淋巴细胞、巨噬细胞、神经胶质细胞、树突状细胞及内皮细胞等多种非神经元细胞均有表达，并且发挥重要功能。该受体能够控制T细胞的凋亡、B细胞的发育及抗体的分泌；调节巨噬细胞和神经胶质细胞释放致炎细胞因子；它还影响树突状细胞的吞噬功能及分泌细胞因子的能力。本实验检测小鼠调节性T细胞是否表达α7nAchR，然后刺激或阻断该受体，观察调节性T细胞免疫抑制活性的变化，进而阐明α7nAchR在调节性T细胞介导的T淋巴细胞免疫抑制功能中的地位。
　　 方法：1.采用免疫磁珠法分选正常C57BL/6J小鼠脾脏CD4+CD25+Treg，流式细胞术鉴定CD4+CD25+Treg细胞的纯度；2.采用免疫荧光染色、Western印迹和逆转录聚合酶链反应技术检测Treg表面α7nAChR蛋白/基因表达。3.不同浓度的烟碱(0.1～10μM)刺激Treg24小时，流式细胞术分析Treg细胞抑制性分子CTLA-4和Foxp3的表达变化；ELISA分析Treg分泌IL-10和TGF-β1的变化；烟碱处理后的Treg与CD4+CD25-T共培养，MTT法检测T淋巴细胞增殖程度；ELISA检测上清液中IL-2、IL-4和IFN-γ浓度变化。最终确定烟碱刺激和Treg细胞免疫抑制活性之间的剂量-效应关系。4.Treg在0.1μM烟碱中孵育不同时间(12～36h)，同样的方法检测Treg的上述功能指标。确定烟碱刺激和Treg细胞免疫抑制活性之间的时间-效应关系。5.用α-银环蛇毒素预孵育Treg细胞，封闭α7nAChR，再用烟碱刺激Treg细胞，观察α-银环蛇毒素能否取消烟碱诱导的效应。
　　 结果：1.免疫磁珠法分选得到的CD4+CD25+T细胞纯度在90％以上，台盼蓝染色显示细胞活性大于97％。2.α-银环蛇毒素-FITC染色，流式细胞仪和共聚焦显微镜成像分析显示Treg细胞表面结合α-银环蛇毒素-FITC；Western印迹检测证实Treg细胞样本中检测到了清楚的α7nAchR条带，分子量大小约为55 kD；RT-PCR分析发现Treg细胞样本中检测到了199bp大小的特异性α7nAchR目的基因条带。3.0.1μM烟碱孵育Treg细胞24h，其抑制活性显著增强(P＜0.01)。进一步研究显示，与未刺激组相比，0.1μM烟碱孵育Treg24h，CTLA-4表达上调(P＜0.01)；0.1μM或1μM烟碱孵育Treg24h，Foxp3表达上调(P＜0.01)；0.1～10μM烟碱孵育Treg24h，Treg细胞分泌IL-10和TGF-β1的能力没有变化；0.1μm烟碱孵育Treg24h，Treg/CD4+CD25-T共培养细胞上清液中IL-2的浓度下降(P＜0.05)。另外，0.1～10μM烟碱孵育Treg24h，Treg/CD4+CD25-T共培养细胞上清液中IL-4/IFN-γ浓度比值没有改变。4.与正常Treg细胞比较，Treg在0.1μM烟碱中孵育12h或24h，其抑制CD4+CD25'T细胞增殖的能力显著增强(P＜0.01，P＜0.05)。进一步研究发现，与正常Treg细胞比较，烟碱孵育12h组Treg细胞CTLA-4和Foxp3表达上调(P＜0.01)，24h组差异也有统计学意义(P＜0.05)；各组上清液中IL-10和TGF-β1浓度没有变化；0.1μM烟碱孵育Treg12小时，Treg/CD4+CD25-T共培养细胞上清液中IL-2浓度比正常Treg组低(P＜0.05)。但是，该组细胞上清液中IL-4/IFN-γ浓度比值与正常Treg组没有差异。5.烟碱刺激组Treg介导的T淋巴细胞免疫抑制活性上调，α-银环蛇毒素+烟碱联合刺激组中烟碱诱导的上述效应消失(P＜0.01)；烟碱上调CTLA-4和Foxp3的表达，α-银环蛇毒素+烟碱联合刺激组中烟碱的上述效应消失(P＜0.01)；烟碱刺激组Treg/CD4+CD25-T共培养细胞上清液中IL-2浓度较正常对照组下降，α-银环蛇毒素+烟碱联合刺激组IL-2浓度恢复至正常对照组水平。另外与正常对照组相比，α-银环蛇毒素刺激组中Treg/CD4+CD25-T共培养上清液IL-4/IFN-γ浓度比值下降(P＜0.01)。
　　 结论：1.小鼠CD4+CD25+Treg细胞表达α7nAChR。2.适当浓度的烟碱可以上调CTLA-4和Foxp3的表达，降低Treg/CD4+CD25-T共培养细胞上清液中IL-2浓度，最终增强Treg介导的T淋巴细胞免疫抑制活性。3.α7nAChR特异性拮抗剂可以逆转碱的上述效应，表明烟碱借α7nAChR产生上述效应，α7nAChR是介导Treg免疫抑制效应的受体之一。4.封闭α7nAChR可以促使Treg极化Th1细胞。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语

声明

前言

第一部分 小鼠CD4+CD25+Treg细胞表达α7烟碱型乙酰胆碱受体

1.1.材料与方法

1.2.结果

1.3.讨论

1.4.小结

1.5.参考文献

第二部分 烟碱对小鼠CD4+CD25+调节性T细胞介导的T淋巴细胞免疫抑制功能的影响

2.1.材料与方法

2.2.结果

2.3.讨论

2.4.小结

2.5.参考文献

第三部分 α7nAchR拮抗剂对烟碱上调Treg免疫抑制活性的影响

3.1.材料与方法

3.2.结果

3.3.讨论

3.4.小结

3.5.参考文献

全文总结

综述一 胆碱能抗炎通路在炎症反应中的作用

综述二 Role of cholinergic anti-inflammatory pathway in regulating host response and its interventional strategy for inflammatory diseases

个人简历

致谢