应用SNP-PCR定量分析造血干细胞移植后NK细胞嵌合体

摘要

目的：探讨利用荧光激活细胞分选技术(fluo-rescence-activated cell sorting, FACS)分离异基因造血干细胞移植术(allogeneic hematopoietic stem cell transpla ntation, allo-HSCT)后受者外周血中微量自然杀伤(naturAlkiller, NK)细胞的可行性及效率；建立一种用于移植后外周血NK细胞系列嵌合体定量分析的新方法——基于单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism, SNP)基因分型的Cycling探针实时荧光定量PCR技术，探讨该技术在检测移植后受者NK细胞植入状态中的应用价值，观察NK细胞嵌合体的形成、演变及其早期监测的意义。
　　 方法：筛选了位于5条不同染色体上的7个特异性SNP位点，合成相应的Cycling探针及引物；抽取4例allo-HSCT病例移植前供、受者及移植后受者的外周血，使用FACS技术分离其外周血中NK细胞，提取基因组DNA，应用基于Cycling探针的荧光定量PCR技术进行患者移植后嵌合状态分析；随机抽取20例无关健康志愿者(其中男9例，女11例)模拟供受者配对，提取其NK细胞基因组DNA，用上述方法检测模拟嵌合体，以评价本方案的可行性、灵敏度和准确性。
　　 结果：①健康志愿者外周血中NK细胞百分数为(12.86±3.62)％，经FACS分选后NK细胞纯度达(96.15±2.03)％，回收率为(95.08±2.16)％；移植后患者外周血中NK细胞百分数(11.01±2.08)％，经FACS分选后纯度达(96.22±2.16)％，回收率为(95.27±1.18)％；②20例健康志愿者组成的模拟供受者及4例患者均至少可以找到一个差异性SNP位点，即该SNP组可以区别78.5％的随机供受者；③对有信息性SNP位点制作质粒标准品，扩增所得标准曲线斜率为-2.3681，截距为36.5919，相关系数为0.995，扩增效率接近理想水平；④模拟供受者DNA模板经SNP-PCR扩增后，模拟嵌合率的实测值与理论值有很好的相关性(R2＞0.99)，两者比较差异无统计学意义(P＞0.01)，可重复敏感度为0.01％。
　　 结论：FACS可以高效、快速、简便地分离纯化外周血中NK细胞，适于分选移植后早期重建的NK细胞；应用基于SNP的实时定量Cyclea ve PCR技术检测移植后受者外周血中嵌合体水平，与传统方法相比该技术灵敏度、准确性和稳定性都有很大的提高；受者外周血中NK细胞嵌合体的变化与疾病状态具有相关性，定量检测可以较早地提示疾病复发、指导临床干预措施从而改善预后。

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综述 异基因造血干细胞移植后细胞亚群嵌合体检测的研究进展

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