急性心肌缺血对正常大鼠及糖尿病大鼠心脏神经节、心房和心室肌Ach、OFQ、NE表达的影响

摘要

目的：
　　 观察心脏神经节分布特征，心脏神经节神经元乙酰胆碱(Ach)和孤啡肽(OFQ)的表达特性及共表达特性，以及结扎冠状动脉左前降支对正常大鼠心脏Ach、OFQ表达的影响和对糖尿病大鼠心脏表达OFQ、NE的影响。
　　 方法：
　　 1、将体重250～300g健康成年SD雄性大鼠随机分为手术对照组（sham组）和结扎冠状动脉缺血组（CAO组），每组14只。CAO组动物于全麻状态下结扎左冠脉前降支，sham组动物只行绕冠脉穿线而不结扎血管。于扎闭冠脉或者冠脉下穿线30min取心脏标本。做全心冠状连续切片，采用HE染色法和尼氏(Nissl)染色法观察心脏神经节的分布特征；采用免疫荧光标记技术观察Ach和OFQ的表达和共表达特性；采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测正常大鼠急性心肌缺血后心房和心室肌组织表达Ach和OFQ的变化。
　　 2、体重180～200g健康成年SD雄性大鼠随机分为5组，糖尿病组、辣椒素干预的糖尿病组、STZ溶剂组、（辣椒素+STZ）溶剂组、空白对照组，每组16只，成模后饲养2.5个月，再将每组等分为sham组和CAO组。采用免疫荧光标记技术观察OFQ和NE的表达变化；采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测糖尿病大鼠心房和心室肌组织表达OFQ和NE的变化。
　　 结果：
　　 1、HE染色和Nissl染色显示，心脏神经节主要分布于心房脂肪挚内、心脏大血管周围脂肪组织内、心房肌间及房室交界处，偶见于心室肌间。心脏神经节细胞呈强嗜碱性，为多角形、椭圆形，核居中，周围有卫星细胞环绕，神经节有结缔组织被膜。
　　 2、免疫荧光双标显示：
　　 (1)40倍视野下随机取sham组15个神经节内190个细胞和CAO组15个神经节内240个细胞计数，结扎冠脉后单纯表达Ach的细胞减少19.2％，单纯表达OFQ的细胞增加4.3％，共表达细胞数量增加13.5％。
　　 (2)Ach和OFQ免疫阳性表达细胞还见于大血管壁、脂肪组织中及心肌间。心房、心室肌也有Ach和OFQ免疫阳性表达。
　　 (3)结扎冠脉组动物神经节细胞Ach免疫荧光强度降低28％(P＜0.01)；心房肌和心室肌Ach荧光光密度CAO组显著低于sham组（心房肌平均光密度降低44％，P＜0.01；心室肌平均光密度值降低36％，P＜0.01）。
　　 (4)结扎冠脉组动物神经节细胞OFQ免疫荧光强度增加22％(P＜0.01)；心房肌和心室肌OFQ荧光光密度CAO组显著高于sham组（心房肌平均光密度值增加59％，P＜0.01；心室肌增加27％，P＜0.01）。
　　 (5)糖尿病大鼠OFQ荧光光密度：神经节：糖尿病CAO组（238.79±1.3）荧光光密度高于正常大鼠组（235.06±2.11），P＜0.05；心房：糖尿病sham组（237.98±1.03）荧光光密度高于正常大鼠组（235.87±0.66），P＜0.05；糖尿病CAO组（240.57±0.69）荧光光密度显著高于正常大鼠组（235.87±0.66），P＜0.01；心室：糖尿病CAO组（245.07±1.07）荧光光密度显著高于正常大鼠组（239.65±1.56）和糖尿病sham组（240.31±0.7），P均＜0.01。
　　 (6)糖尿病大鼠NE荧光光密度：神经节：糖尿病sham组（235.98±2.08）和CAO组（237.75±1.29）荧光光密度显著高于正常大鼠组（222.98±4.6），P均＜0.01；心房：糖尿病sham组（230.45±0.82）和CAO组（236.44±2.66）荧光光密度显著高于正常大鼠组（218.44±4.10），P均＜0.01；心室：糖尿病sham组(236.07±1.82)和CAO组（240.31±1.08）荧光光密度显著高于正常大鼠组(230.46±2.67)，P均＜0.01。
　　 3、ELISA结果显示：
　　 正常大鼠
　　 (1)结扎冠脉后30min，CAO组心房和左心室表达Ach均下调（心房：sham组为32.75±1.66nmol/L，CAO组28.38±4.57nmol/L，P＜0.05；心室：sham组为49.22±7.62nmol/L，CAO组为40.08±3.99nmol/L，P＜0.05）；
　　 (2)结扎冠脉后30min，CAO组心房和左心室表达OFQ均上调(心房：sham组为1.33±0.10pg/ml，CAO组为1.55±0.14pg/ml，P＜0.05；心室：sham组为1.4±0.10pg/ml，CAO组为1.55±0.16pg/ml，P＜0.05)。
　　 DM大鼠
　　 (1)OFQ:
　　 糖尿病组比其溶剂对照组OFQ含量升高，辣椒素干预组与糖尿病组及溶剂对照组相比OFQ含量均升高，缺血后各组OFQ均升高。其中：糖尿病组比其对照组升高（心房无差异，心室sham25％、CAO14％）；辣椒素干预组比糖尿病组升高（心房sham1.3％，CAO2.4％；心室sham11.2％，CAO17.7％）；辣椒素干预组比其对照组升高（心房sham5.3％，CAO7.2％，心室sham38％，CAO0.8％）；CAO组OFQ含量比sham组增高(各组依次为：心房3.8％、5％、2.1％、3.1％、3.2％；心室9.7％、16.2％、20.1％、47.4％、2％)。
　　 (2)NE：
　　 糖尿病组比其溶剂对照组NE含量升高，辣椒素干预组NE含量低于DM组，缺血后各组NE高于假手术组。其中：糖尿病组NE含量比其对照组增高（心房sham5.1％，CAO无差异；心室sham49％，CAO5％）；辣椒素干预组NE含量比糖尿病组降低（心房sham组11.55％，CAO组0；心室sham组2.04％、CAO组22.7％）；辣椒素干预组NE含量比其溶剂对照组增高（心房sham9.4％，CAO无差异；心室sham24％，CAO无差异）结扎冠脉后各组NE含量均升高(各组依次为：心房8.6％、21.4％、13.9％、2.8％、20％；心室37.4％、14.1％、95％、40.2％、53.6％)。
　　 结论：
　　 心脏神经节内存在分别表达Ach与OFQ的细胞和Ach与OFQ共表达细胞。Ach和OFQ阳性细胞还见于大血管壁、脂肪组织及心肌间。急性心肌缺血30分钟，OFQ表达细胞增多而Ach表达细胞减少；心肌组织表达OFQ上调而表达Ach下调。研究结果提示，乙酰胆碱和孤啡肽表达于心脏神经节细胞和心肌组织，可能共同参与了急性心肌缺血早期病理过程。糖尿病大鼠心肌缺血早期，心脏神经节、心房和心室OFQ含量上调，而NE表达下调。同时，小剂量的辣椒素可能促进辣椒素敏感神经递质OFQ和交感神经递质NE的释放，这些因素均参与了糖尿病大鼠急性心肌缺血早期的病理过程。

目录

声明

缩略语表

摘要

前言

第一章 急性心肌缺血对正常大鼠心脏神经节、心房、心室肌乙酰胆碱、孤啡肽表达的影响

1、引言

2、实验仪器、药品试剂及实验动物

2.1 主要仪器

2.2 试剂和药品

2.3 实验动物

3、动物分组及模型的制备

3.1 实验动物分组

3.2 实验动物模型的制各

4、HE染色和尼氏染色

4.1 HE染色

4.2 Niss1染色

5、荧光免疫组织化学(FIHC)

5.1 荧光免疫组化程序

5.2 荧光光密度测定和共表达分析

6、酶联免疫吸附法(ELISA)

6.1 蛋白提取和定量

6.2 ELISA程序及标准曲线

7、统计学处理

8、实验结果

8.1 HE染色和尼氏染色

8.2 荧光免疫组化结果

8.3 ELISA结果

9、讨论

第二章 急性心肌缺血对糖尿病大鼠心房、心室肌孤啡肽、去甲肾上腺素表达的影响

1、引言

2、实验仪器、药品试剂及实验动物

2.1 实验仪器

2.2 药品试剂

2.3 实验动物

3、动物分组及模型的制备

3.1 动物分组

3.2 模型制备及成模标准

4、荧光免疫组织化学(FIHC)

4.1 荧光免疫组织化学程序(同前)

4.2 荧光光密度检测(同前)

5、酶联免疫吸附法(ELISA)

5.1 蛋白提取和定量

5.2 ELISA程序及标准曲线

6.统计学处理

7.实验结果

7.1 糖尿病大鼠血糖和体重变化曲线

7.2 荧光免疫组化结果

7.3 ELISA结果

8.讨论

第二部分 文献综述

参考文献

实验部分

综述部分

个人简介

致谢