脂质体纳米探针的构建及信号放大策略在生物分子检测中的应用研究

摘要

近年来，在生命分析化学领域中，对生物分子的检测方法要求越来越高，构建对生物大分子简单快速、灵敏精确、经济实惠、便捷有效的检测策略已成为生命分析科学领域中研究的重点和热点。
　　生物分子信号放大技术在各种工具酶和纳米磁球等生物材料的基础上发展起来，它是一种前沿的分析技术，被广泛地应用于生物分子的检测。血糖仪（PGM）是床边检测仪器（Point-of care testing POCT)的一个重大突破，它不仅能够方便地为家庭商购获得，而且检测过程还脱离了实验室的条件和仪器操作。由于它的便携式“袖珍“尺寸、成本划算、定量测定可靠、操作简单和即时得出结果等优点已经被广泛应用。脂质体具有理想的生物相容性和巨大的内部空腔，可以包封大量的生物分子设计成纳米探针。因此，我们设计了以工具酶和纳米磁球等为材料的荧光信号放大策略，并构建出以多功能脂质体纳米探针为基础的PGM检测策略，实现了生物大分子的灵敏、经济、精确、便携检测。
　　本论文分别利用PGM检测和荧光检测两种检测手段，主要以Dam甲基转移酶、磷脂酶D为研究对象，构建了多种新的信号放大检测技术平台，实现了其定量分析。主要内容包括：
　　1、基于目标物控制脂质体“开-关”的级联放大策略构建灵敏精确检测乳腺癌细胞中磷脂酶D的新方法
　　本章主要是基于目标物控制脂质体（TCGL）“开-关”的级联放大策略，用PGM对磷脂酶 D进行定量检测。首先，我们将葡糖淀粉酶包裹于脂质体之中，无需对葡糖淀粉酶进行标记，省去了标记的复杂过程，保持了酶的原有生物活性。其次，检测过程中使用便携式定量设备血糖仪，绕开了对复杂仪器的需求以及相应的复杂操作，使我们的方法可以简单、灵活地应用于原位检测。该方法对磷脂酶 D的检测限达到0.005 U L-1。此外，我们进一步在乳腺癌细胞中对磷脂酶D实行活性检测并且做了抑制剂药物筛选实验，都取得了很好的效果。
　　2、基于磁球/脂质体杂交探针构建血糖仪灵敏便携检测DNA甲基转移酶的新方法
　　本章以磁球/脂质体杂交探针为基础，构建了一种以PGM为检测工具，简单便携、灵敏度高、特异性强的DNA甲基转移酶活性检测以及抑制剂筛选的新方法。首先，我们将p1DNA功能化的磁球与p2DNA功能化的包裹葡糖淀粉酶的脂质体（GEL）杂交制备磁球-脂质体杂交探针。然后，在DNA甲基转移酶的存在下，杂交探针被甲基化，进一步被对甲基化位点敏感的限制性内切酶Dpn I切割，通过磁分离，脂质体从磁球上分离下来。最后，用1％的Triton X-100溶液对分离下来的脂质体进行裂解，释放出葡糖淀粉酶，葡糖淀粉酶将信号底物淀粉催化水解，产生大量的葡萄糖，随之用血糖仪对葡萄糖进行定量检测，检测限达到2.0×10?4 U mL?1。此外，我们进一步在人血清中进行了Dam甲基转移酶的活性检测实验，取得了较好的结果。
　　3、基于磁性纳米颗粒协同核酸外切酶III辅助的循环放大构建灵敏精确检测DNA甲基转移酶的新方法
　　本章构建了一种Dam甲基转移酶活性检测的荧光磁性生物传感器，这种传感器基于磁性纳米粒子协同核酸外切酶III辅助的循环指数扩增与超分子结构锌原卟啉/G-四链体相结合的协同信号放大策略。在该传感器中，少量的甲基转移酶可诱导出大量稳定的DNA触发器，导致了目标物的显著扩增。而且，用磁性纳米粒子作为传感器的载体可以在实际样品中减少干扰，这增强了传感体系的抗干扰性。基于这种独特的扩增策略，测出的检测限为2.0×10?4 U mL?1。此外，该传感器不仅可用于评估大肠杆菌细胞不同生长阶段中甲基转移酶的活性，还可以进行甲基转移酶抑制剂的筛选。

目录

声明

前言

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 脂质体纳米材料

1.3生物分子信号放大检测技术

1.4 本论文拟开展的工作

第二章 基于目标物控制脂质体“开-关”的级联放大策略构建新方法灵敏精确检测乳腺癌细胞中的磷脂酶D

2.1 引言

2.2 实验用品

2.3实验步骤

2.4实验结果与讨论

2.5 结论

第三章 基于磁球/脂质体杂交探针构建血糖仪灵敏便携检测DNA甲基转移梅的新方法

3.1引言

3.2实验用品

3.3 实验步骤

3.4实验结果与讨论

3.5结论

第四章 基于磁性纳米颗粒协同核酸外切酶III辅助的循环放大构建灵敏精确检测DNA甲基转移酶的新方法

4.1引言

4.2 实验用品

4.3 实验步骤

4.4 实验结果与讨论

4.5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文