利用GRATEN系统检测DNA双链断裂及基因组编辑研究

摘要

基因组编辑技术能够通过在基因组中进行靶向特异性的突变，从而为了解基因功能和开展基因治疗等提供技术支持。基因组编辑(genome editing, GE)技术利用构建的人工内切酶，在基因组靶位点对双链进行切割，产生的DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs)能够被细胞内的DNA修复系统在修复过程中产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。该技术对破译基因功能和开展基因治疗等是一种有力的工具，建立能够快速、准确检测 DSBs 的技术则显得尤为重要。本研究建立了一种方便快捷地检测DNA的DSBs引起的基因重组的方法。对DSBs进行检测是研究GE产生及其效率的关键。传统的检测DSBs的方法主要有γ-H2AX检测方法和荧光报告基因检测。γ-H2AX作为DNA的损伤标记，通过检测γ-H2AX，进而检测DNA双链断裂。但是，该方法较为复杂，操作比较繁琐。甚至有部分细胞活动并不导致DSBs的产生，仍然有可能产生γ-H2AX。而荧光报告基因检测方法是通过构建突变的荧光蛋白载体来实现的。但是该方法只能检测到使荧光蛋白基因恢复读码框的突变，且主要在转基因植物中进行，操作并不简便。总之，传统的检测DSBs的方法较为复杂、繁琐。因此，构建简单、快速的此类检测技术是非常必要的。 本研究包括：(1)构建了正向重复片段的GUS基因载体，利用其重组并恢复表达以检测DSBs；(2)建立了由引导RNA和噬菌体MS2外壳蛋白偶联限制性核酸内切酶(guided RNA and tethered endonuclease, GRATEN)的基因组编辑系统，在 GUS 基因内部 DNA 重复区切割，导致 DSBs，DSBs 经同源序列引导修复(homology-directed repair, HDR)途径，引起GUS基因重组，恢复其功能。我们在烟草叶片中进行瞬时表达的操作，从而完成对DSBs的检测。借助正向重复片段的GUS显色，更加便于观察。整个系统的特点是设计简单，对打靶序列没有特异性的要求，建立一种简单、精确和高效的新型植物基因组编辑技术体系。此方法可以经过GUS染色后快速、直观地检测位点特异的DSBs。通过GUS与其底物的反应，以达到半定量、直观快速检测DSBs的目的。 目前常用的GE技术有：(1)人工介导的锌指核酸酶技术(zinc finger nuclease,ZFN)；(2)转录激活因子类效应子核酸酶技术(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)；(3)由RNA介导的成簇规律性间隔的短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)系统。这三种技术都是通过对DNA双链的特定位点进行识别，从而切割造成DSBs。但是，ZFN、TALEN或是 CRISPR 系统在实际应用中都存在缺陷，即都可在非目标位点进行打靶，从而造成脱靶现象。我们利用 GRATEN 系统对 GUS 基因进行定点突变，结果表明可产生GUS基因内部较大DNA片段的缺失，说明该技术在基因组编辑中是切实可行的。

目录

声明

前言

第一章 绪论

1.1 基因组编辑技术概况

1.1.1 锌指核酸酶技术

1.1.2 转录激活因子类效应子核酸酶技术

1.1.3 由RNA介导的成簇规律性间隔的短回文重复系统

1.2 DNA双链断裂检测

1.2.1γ-H2AX检测方法

1.2.2 荧光报告基因检测

1.2.3 GRATEN系统

第二章 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 扩增引物及实验工具酶

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 主要溶液配制

2.2 方法

2.2.1 利用氯化钙法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞

2.2.2 利用热激法转化大肠杆菌感受态细胞

2.2.3 利用电转法转化农杆菌感受态细胞

2.2.4 本氏烟草的种植

2.2.5 用渗透注射法对本氏烟草进行瞬时表达

2.3 GRATEN系统的构建

2.4 部分重复序列的GUS基因(GUUS)的构建

2.5 植物材料及转基因操作

2.6 GUS染色及观察

2.7 突变基因的筛选

2.7.1 本氏烟草的基因组DNA提取

2.7.2 获取突变基因

2.7.3 突变基因的检测与筛选

第三章 结果与分析

3.1 GRATEN系统的分析

3.1.1 GRATEN系统的构建

3.1.2 烟草叶片的瞬时表达

3.1.3 实验结果观察

3.2 突变基因的检测

Target GUS gene：

第四章 讨论与展望

4.1 讨论

4.2 展望

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文