根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯治疗系膜增生性肾病的实验研究

摘要

系膜细胞异常增殖是增生性肾小球疾病共同的病理改变，系膜细胞过度增殖可引起系膜基质增多，最后导致肾小球硬化、终末期肾衰竭的发生。因此，抑制系膜细胞过度增殖可以延缓、阻止肾小球疾病的进展。从2008年开始，本课题组开始探索按照细胞周期动力学原理选用两种可以将细胞周期阻滞于不同时相的免疫抑制剂，联合治疗系膜增生性肾小球疾病，这种用药方案是否具有更好的治疗效果，本课题将予以研究。
　　本实验包括以下五部分：
　　第一部分他克莫司和霉酚酸酯对体外培养的人系膜细胞周期的影响
　　目的：
　　探讨他克莫司和霉酚酸酯对人系膜细胞细胞周期的作用。
　　方法：
　　人系膜细胞分为对照组和用药组，用药组分别加入1μmol/L、5μmol/L的他克莫司或2.5μmol/L、10μmol/L的霉酚酸酯，分别培养24h、48h、72h，用MTT法测细胞增殖、流式细胞仪测细胞周期、流式细胞仪测细胞凋亡。
　　结果：
　　5μmol/L他克莫司作用于人系膜细胞48 h，细胞在S期的比例下降了41％，在G0/G1期的百分比增加，1μmol/L和5μmol/L的他克莫司作用48 h均未对人系膜细胞的细胞凋亡产生影响。2.5μmol/L和10μmol/L的霉酚酸酯作用24,48以及72h均可抑制人系膜细胞的增殖，明显抑制细胞进入G2/M期，2.5μmol/L和10μmol/L的霉酚酸酯作用于人系膜细胞48h均可引起细胞凋亡且呈剂量依赖性，10μmol/L的霉酚酸酯引起的细胞凋亡更明显。
　　结论：
　　他克莫司可以阻断人系膜细胞由G1期进入S期，霉酚酸酯可以阻断人系膜细胞由S期进入G2期，二者可以将细胞周期阻滞于不同时相。
　　第二部分他克莫司和霉酚酸酯抑制人系膜细胞周期性增殖的机制
　　目的：
　　探讨他克莫司和霉酚酸酯抑制人系膜细胞周期性增殖的机制。
　　方法：
　　实验1分为正常对照组（CTL组）、TGF-β1组、正常对照+他克莫司组（CTL+TAC组）、TGF-β1+他克莫司组（TGF-β1+TAC组）。实验2分为正常对照组（CTL组）、PDGF组、正常对照组+霉酚酸酯组（CTL+MMF组）、PDGF+霉酚酸酯组（PDGF+MMF组）。分别用Western blotting法检测各组Smad2蛋白质的表达、p38蛋白质磷酸化的水平。
　　结果：
　　Western Blotting结果1:与CTL组相比，TGF-β1组Smad2蛋白质表达水平显著上调（P<0.01）；与CTL组相比，CTL+TAC组Smad2蛋白质表达水平明显下降（P<0.01）；与TGF-β1组相比，TGF-β1+TAC组Smad2蛋白质表达水平降低（P<0.01）。Western Blotting结果2:与CTL组相比，PDGF组PP38/P38显著上调（P<0.01）；与CTL组相比，CTL+MMF组PP38/P38明显下降（P<0.01）；与PDGF组相比，PDGF+MMF组PP38/P38降低（P<0.01）。
　　结论：
　　他克莫司通过影响TGF-β1/Smad2信号通路从而抑制系膜细胞增殖，霉酚酸酯通过影响p38信号通路从而抑制系膜细胞增殖。
　　第三部分根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制体外培养的人系膜细胞增殖
　　目的：
　　研究与使用单药相比，他克莫司与霉酚酸酯联合使用抑制体外培养的人系膜细胞增殖效果是否更好。
　　方法：
　　人系膜细胞随机分为正常对照组(CTL组）、PDGF组、PDGF+他克莫司组(PDGF+T组）、PDGF+霉酚酸酯组(PDGF+M组）、PDGF+他克莫司组+霉酚酸酯组（PDGF+T+M组）。CTL组为常规培养的HMC；PDGF组用20ng/ml的PDGF刺激HMC,继续培养48h；PDGF+T组用20ng/ml的PDGF刺激HMC,培养24h,用5μmol/L TAC处理细胞，继续培养24h；PDGF+M组：用20ng/ml的PDGF刺激HMC,培养24h,用10μmol/L MMF处理细胞，继续培养24h；PDGF+T+M组:用20ng/ml的 PDGF刺激 HMC,培养24h,用2.5μmol/L TAC和5μmol/L MMF处理细胞，继续培养24h。采用免疫荧光染色的方法检测Ki67阳性的细胞核比例，采用Western blot的方法检测Cyclin D1蛋白质的表达。
　　结果：
　　免疫荧光染色结果证实，与CTL组相比，PDGF组Ki67阳性的细胞核比例明显升高（P<0.01）；与PDGF组相比， PDGF+T组和PDGF+M组Ki67阳性的细胞核比例明显下降（P<0.01）；与PDGF+T组和PDGF+M组相比，PDGF+T+M组Ki67阳性的细胞核比例降低（P<0.01）；PDGF+T组和PDGF+M组无统计学差异。Western Blotting结果表明，与CTL组相比，PDGF组Cyclin D1蛋白质表达水平显著上调（P<0.01）；与PDGF组相比， PDGF+T组和PDGF+M组Cyclin D1蛋白质表达水平明显下降（P<0.01）；与PDGF+T组和PDGF+M组相比， PDGF+T+M组Cyclin D1蛋白质表达水平降低（P<0.01）。
　　结论：
　　他克莫司与霉酚酸酯联合使用并且剂量减半，抑制体外培养的人系膜细胞增殖的作用更强。
　　第四部分根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制狼疮性肾炎小鼠系膜细胞增殖
　　目的：
　　研究与使用单药相比，他克莫司与霉酚酸酯联合使用抑制狼疮性肾炎小鼠系膜细胞增殖效果是否更好。
　　方法：
　　随机分为野生型小鼠组（Wt组）、狼疮型小鼠组（Lupus组）、狼疮型小鼠+他克莫司组（Lupus+TAC组）、狼疮型小鼠+霉酚酸酯组（Lupus+MMF组）、狼疮型小鼠+他克莫司+霉酚酸酯组（Lupus+TAC+MMF组）。Lupus+TAC组为狼疮型小鼠使用1mg/kg﹒d TAC腹腔注射；Lupus+MMF组为狼疮型小鼠使用60mg/kg﹒d MMF灌胃；Lupus+TAC+MMF组为狼疮型小鼠使用0.5mg/kg﹒d TAC腹腔注射+30mg/kg﹒d MMF灌胃。Lupus+TAC组、Lupus+MMF组和Lupus+TAC+MMF组从小鼠3月龄时开始用药，6月龄时实验结束，5组实验动物同时处死，留取肾组织进行PAS染色、MASSON染色观察各组肾脏系膜细胞增生的情况，采用免疫组化的方法检测Ki67和PDGF的表达，采用Western blot的方法检测Cyclin D1、PDGF蛋白质的表达。
　　结果：
　　PAS和MASSON染色结果显示，Lupus组小鼠系膜细胞明显增生， Lupus+TAC组、Lupus+MMF组的病理改变较Lupus组有所减轻， Lupus+TAC+MMF组与Lupus+TAC组、Lupus+MMF组相比，系膜细胞增生减轻。免疫组化结果显示， Lupus组可见到Ki67、PDGF表达较Wt组明显增高(P<0.01)，Lupus+TAC组、Lupus+MMF组较Lupus组的表达显著减少(P<0.01)， Lupus+TAC+MMF组与Lupus+TAC组、Lupus+MMF组相比，Ki67、PDGF表达明显减少(P<0.01)。Western Blotting结果表明，Lupus组可见到Cyclin D1、PDGF表达较Wt组明显增高(P<0.01)，Lupus+TAC组、Lupus+MMF组较Lupus组的表达显著减少(P<0.01)，Lupus+TAC+MMF组与Lupus+TAC组、Lupus+MMF组相比，Cyclin D1、PDGF表达明显减少(P<0.01)。
　　结论：
　　他克莫司与霉酚酸酯联合使用并且剂量减半，在狼疮性肾炎小鼠体内抑制系膜细胞增殖的作用更强。
　　第五部分根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制狼疮性肾炎患者系膜细胞增殖
　　目的：
　　观察根据细胞周期联合使用他克莫司与霉酚酸酯抑制狼疮性肾炎患者系膜细胞增殖的效果，并且研究该用药方案的治疗效果和不良反应。
　　方法：
　　6例经肾组织穿刺活检明确病理类型为IV型的狼疮性肾炎患者，接受他克莫司(2mg，每天口服两次)、霉酚酸酯(500mg，每天口服两次)、甲基泼尼松龙联合治疗，治疗6个月并进行随访。随访结束后，再次进行肾组织穿刺活检。比较6位患者治疗前后SLADAI评分、24小时蛋白尿、血Scr水平、血白蛋白水平、抗dsDNA抗体、补体C3等临床指标，采用免疫组化法检测肾组织中Ki67、PDGF、CyclinD1的表达。
　　结果：
　　这6位患者经过他克莫司和霉酚酸酯联合治疗，SLADAI评分、24小时蛋白尿、血Scr水平、血白蛋白水平等临床指标均明显好转，肾脏病理损伤减轻， PDGF、Ki67、Cyclin D1在系膜细胞中的表达明显减少，未发生严重的不良反应。
　　结论：
　　根据细胞周期联合使用他克莫司与霉酚酸酯抑制狼疮性肾炎患者系膜细胞增殖的效果显著，该用药方案的治疗效果较好，不良反应少，安全性高。

目录

封面

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常用缩写词中英文对照表

前言

参考文献

第一部分 他克莫司和霉酚酸酯对体外培养的人系膜细胞周期的影响

1 材 料 与 方 法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

第二部分 他克莫司和霉酚酸酯抑制体外培养的人系膜细胞增殖的机制

1 材 料 与 方 法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

第三部分 根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制体外培养的人系膜细胞增殖

1 材 料 与 方 法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

第四部分 根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制狼疮性肾炎小鼠系膜细胞增殖

1 材 料 与 方 法

2 结 果

3讨 论

参考文献

第五部分 根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制狼疮性肾炎患者系膜细胞增殖

1 资 料 与 方 法

2 结 果

3讨 论

参考文献

结论

综述:狼疮性肾炎的治疗新进展

致谢

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