GFP转基因小鼠脊髓源NSCs移植于小鼠脊髓损伤模型后的成活分化情况

摘要

目的： (1)通过无血清培养技术从GFP+-小鼠胚胎脊髓分离和培养神经干细胞（NSC），采用免疫荧光技术鉴定NSC。 (2)建立小鼠脊髓损伤模型，向脊髓损伤处附近注射 GFP+-神经干细胞，观察小鼠运动恢复情况和GFP+-神经干细胞在体内的成活、分化情况，揭示神经干细胞在临床中治疗脊髓损伤的作用。 方法： (1) GFP转基因小鼠的繁殖； (2)通过从GFP转基因小鼠的胎鼠体内获得脊髓源神经干细胞，体外分离培养并鉴定； (3)将小鼠随机分为空白组（30只），损伤组（30只）与细胞移植组（30只），采用Impactor M-III脊髓撞击器，对小鼠暴露的脊髓进行击打建立小鼠脊髓损伤模型。细胞移植组在击打后向损伤处注入5μL神经干细胞悬液；损伤组仅仅只击打脊髓；空白组不做任何处理； (4)在1w、2w、4w、6w和8w不同时间节点进行行为学观察，记录小鼠的BBB运动功能评分和斜板实验结果；同时也在1w、2w、4w、6w和8w时，每组分别处死6只小鼠，3只用于免疫组织化学检测和尼氏（Nissl）染色，另3只通过荧光定量PCR技术检测Nestin、ChAT和GFAP基因表达量的变化情况，观察NSC在小鼠脊髓损伤模型内的成活、分化状态及损伤脊髓的修复情况。 结果： 体外成功培养出了神经干细胞，将传至第三代的神经干细胞接种到载玻片，荧光显微镜下观察到细胞呈规则的圆形，折光性强，界限清晰，神经球发出很强的绿色荧光。免疫荧光法检测，Nestin表达呈阳性。采用Impactor M-III脊髓撞击器，对小鼠暴露的脊髓进行击打建立小鼠脊髓损伤模型。击打后小鼠双后肢均瘫痪，BBB评分为0，移植2 w后移植组较损伤组BBB评分有显著差异（P<0.05），4 w移植组较损伤组斜板倾斜角度有明显差异（P<0.05）。荧光显示移植的 NSCs会在体内存活并迁移，部分保持未分化状态，少部分分化为胶质细胞，向神经元分化较少。PCR结果与免疫组织化学染色结果一致，Nestin显示在注射初期，移植组的Nestin的表达量明显高于损伤组，2w后差距开始减少，并在6w后与空白组表达接近；移植组与损伤组的ChAT的表达在损伤初期均减少，2 w时开始增多，移植组的增长明显高于损伤组；两组 GFAP的表达在损伤后表达持续升高，但移植组GFAP的表达低于损伤组。Nissl染色结果显示损伤1w~2w时，移植组与损伤组的尼氏小体数量均持续减少；但4w后开始出现新的尼氏小体，而且移植组的尼氏小体数量比损伤组的数量多。 结论： (1)体外移植的神经干细胞可以在体内存活、分化。 (2) NSCs对脊髓损伤的恢复有促进作用，这种作用是通过移植细胞后形成一个有利于恢复的微环境，增加向神经元分化的比例来促进恢复。

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前言

1 材料与方法

1.1材料

1.2方法

2 结 果

2.1 GFP转基因小鼠的饲养

2.2 神经干细胞的形态和鉴定

2.3 脊髓损伤模型的制作与细胞移植

2.4 行为学观察

2.5免疫荧光检测

2.6 Nissl染色

2.7 荧光定量PCR对Nestin、ChAT、GFAP检测

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述: 实验条件下对于脊髓损伤采用的细胞治疗后的功能恢复

致谢

在学期间承担/参与的科研课题与研究成果

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