双价抗虫基因杨的获得、抗虫鉴定及安全性评价

摘要

杨树属杨柳科(Salicacea)杨属(Populus)，是世界上分布最广、适应性最强的树种，对保持生态平衡起着重要的作用，它不仅是世界上最重要的纸浆原料，还是优良的再生能源的原料。但杨树虫害发生严重，造成了严重的经济损失和生态损失。利用基因工程培育抗虫品种是提高杨树抗虫性的有效途径。我国是世界上第一个商业化种植转基因抗虫杨的国家，所采用的基因为苏云金芽孢杆菌内毒素基因（Bt基因），但单一基因易引起害虫抗性的产生，同时转入两个或两个以上抗虫基因能有效延缓害虫抗性的产生，同时提高转基因品种的抗虫性，扩大其扩虫谱。本研究发明了不需通过植物组织培养的“原位叶芽基因转化法”，并采用该方法将源于东亚钳蝎的昆虫特异性毒素(BmkIT)基因与源于烟草天蛾的几丁质酶(chitinase)基因构建的双价基因导入杨树，并分析了该双价基因的抗虫效果，探讨了其抗虫枫理，进而以食草动物兔子为动物材料，研究了转chitinase-BmkIT杨树叶作为青饲料的安全性问题。获得的主要结果如下:
　　一、原位叶芽转化双价基因
　　以青杨(Populus cathayana Rehd)品种中林美荷为供试植物材料，连续三年采用农杆菌介导的原位叶芽转化法对双价基因chitinase-BmkIT进行转化，结果表明，该方法能够将外源基因转入杨树中，顶芽的转化率高于侧芽。虽然该方法会产生嵌合体，通过连续两年用标记抗生素卡那霉素筛选及PCR扩增检测，淘汰了嵌合体，分别得到1％(2006年)和2.24％(2007年)的转化率，Southern杂交表明，双价基因确已整合到杨树基因组中，整合方式既有单拷贝也有多拷贝。将转化枝扦插繁殖后，分子检测证明外源基因可以通过无性繁殖方式遗传。
　　二、转双价基因杨的抗虫性鉴定
　　分别以蛀杆害虫光肩星天牛幼虫和食叶害虫美国白蛾幼虫为供试虫源，进行了抗虫研究。通过对一龄光肩星天牛取食转基因杨树茎干30天后与对照比较，表明转chitinase-BmkIT基因杨对天牛生长基本无抑制作用，表现在取食转基因杨茎杆的天牛与取食非转化对照的天牛体重和体长均无显著差异(p＞0.05)，且观察表明，两组天牛所蛀隧洞大小也无明显差异。
　　转chitinase-BmkIT基因杨对美国白蛾有一定的抑制作用，表现在取食转基因叶片不仅对美国白蛾当代的生长发育产生了抑制和致死作用，且对其后代的繁衍造成了抑制。研究结果表明，取食转基因株系杨树叶片使美国白蛾的死亡率显著提高，且对美国白蛾幼虫身长和体重的抑制显著高于取食非转化株系(p＜0.05)，而且，取食转基因叶片使部分美国白蛾幼虫不能化蛹，即使化蛹，却不能羽化或羽化不正常，未能交配即死亡，因而可以有效降低美国白蛾的危害。
　　三、转双价基因杨的抗虫机理探讨
　　为探讨双价基因chitinase-BmkIT的抗虫机理，以转双价基因(chitinase-BmkIT)杨树叶片饲喂美国白蛾幼虫，采用石蜡切片法，对美国白蛾幼虫中肠结构进行观察，并对其头部乙酰胆碱酯酶活性进行测定。结果表明:取食转基因杨树叶片的美国白蛾幼虫中肠结构不完整，中肠细胞出现排列不整齐、脱落等现象。本试验中，取食未转化叶片的美国白蛾幼虫头部乙酰胆碱酯酶活性显著高于对照处理，极有可能是BmkIT基因表达的结果。兴奋型昆虫特异性神经毒素BmkIT可能会通过抑制乙酰胆碱酯酶活性，造成昆虫过度兴奋而死亡或生长受抑。几丁质酶通过水解几丁质发挥作用，中肠切片表明，取食转化叶片的幼虫中肠结构不完整，有细胞脱落、断裂现象，表明外源几丁质酶在昆虫体内仍有活性，并通过对围食膜的破坏造成昆虫易感病、拒食、身体溃烂等现象。切片观察与乙酰胆碱酯酶活性测定为证实此双价基因的抗虫效应和阐明此双价基因的抗虫机理提供了证据。
　　四、转双价基因杨对兔子的安全评价
　　为明确转双价抗虫基因（chitinase-BmkIT）杨作为饲料的安全性，本研究以食草动物兔子为材料，通过连续70天饲喂一定量的转基因或非转基因对照杨树新鲜叶片，比较了饲喂前后血常规及血生化部分指标;记录了取食转基因叶片及非转化叶对兔子生长的影响;对处理组和对照组兔子解剖后观察并称重，分析了两组的脏器比;石蜡切片比较了处理组和对照组兔子的组织形态结构;检测了外源基因在兔子组织中的整合情况。结果表明:取食转基因杨树叶与非转化叶兔子的生长无显著差异;处理组兔的肝脏重于对照组，但两组兔子的肝组织形态均正常，且无差异，其它脏器如肾、脾、胃、小肠、心脏、肺均无病理变化;试验结束后，两组兔子的生化及血常规指标均无显著差异;源于转基因杨树叶的chitinase，BmkIT, kanamycin均未在兔子的小肠、血液及肌肉中检出。以上结果初步说明，转基因杨树叶片作为兔子饲料是安全的。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 杨树的概述

1．1 杨树的生物学特征及分布

1．2 杨树在国民经济及林业中的地位和发展概况

1．3 杨树的主要虫害

2．杨树遗传基因改良的研究进展

2．1 杨树基因工程的主要研究领域

2．2 抗虫基因概况

2．3 杨树抗虫基因工程研究现状

2．4 杨树抗虫基因工程存在的问题及解决策略

3．基因转化方法的研究进展

3．1 载体转化技术

3．2 直接转化技术

3．3 种质转化技术

4．基因转化方法展望

5．论文的设计思路

5．1 研究背景

5．2 研究内容、目的及方案

参考文献

第二章 农杆菌介导杨树叶芽原位转化双价抗虫基因

1．引言

2．材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3．结果与分析

3．1 卡那霉素临界浓度的确定

3．2 直接筛选非嵌合细胞

3．3 卡那霉素对可能转化芽的筛选

3．4 PCR结果分析

3．5 Southern分析

3．6 转化枝的无性繁殖

4．讨论

参考文献

第三章 转双价基因杨树株系的抗虫性鉴定

1．引言

1．2 昆虫几丁质酶基因概述

1．2 东亚钳蝎昆虫毒素概述

2．材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 转基因株系对一龄光肩星天牛的的杀虫效果及生长影响

3．2 转基因株系对美国白蛾的的杀虫效果及生长发育的影响

4 讨论

参考文献

第四章 转基因抗虫杨抑制美国白蛾的作用机理研究

1．引言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 转双价基因杨对美国白蛾幼虫中肠结构的影响

3．2 转基因杨树对美国白蛾幼虫乙酰胆碱酯酶活性的影响

4 讨论

参考文献

第五章 转基因杨树叶对兔子的安全评价

1．引言

2．材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 转基因杨树对兔子生长的影响

3．2 血常规及生化分析

3．3 兔子内脏器官重量及脏体比分析

3．4 兔子内脏组织形态比较

3．5 兔子肌体组织中外源基因的检测

4．讨论

参考文献

附录Ⅰ 基本方法与技术

一、个人简介

二、攻读博士学位期间发表的论文

三、申请专利

四、参与的科研项目

致谢

声明