八肋游仆虫中心蛋白在溶液中的聚集性质研究

摘要

中心蛋白(Centrin)是属于EF-hand钙结合蛋白超家族的分子量较小(约20kD)的酸性蛋白。最初中心蛋白是作为鞭毛单细胞生物中连接核和鞭毛器的纤维的主要成分被鉴定得到的，随后发现中心蛋白是中心粒，中心体和有丝分裂纺锤体极体中一种广泛存在的成分，与细胞的分裂，细胞中中心体的定位、定向，纺锤体极体分离，微管切除，纤维系统的收缩等有关。其中基于中心蛋白的纤维系统的收缩现象，与在Ca2+存在下，不论是酵母，藻类或是人类的中心蛋白都会形成多聚体密切相关。
　　八肋游仆虫中心蛋白(EoCen)是从一种在进化上处于特殊地位的单细胞真核生物——八肋游仆虫中克隆得到的，将其作为研究金属离子(Ca2+、Ln3+)进入体内的靶蛋白模型，对于阐明稀土生物效应的分子基础具有重要的意义。EoCen共含有168个氨基酸残基，与人中心蛋白1(HsCen1)，人中心蛋白2(HsCen2)和人中心蛋白3(HsCen3)的序列同源性分别为60％，62％和66％，与研究最为广泛的EF-hand结构蛋白钙调蛋白(CaM)的同源性为50％。最近，八肋游仆虫中心蛋白N端结构域的NMR结构刚刚被报道(2joj.pdb)。与CaM一样，EoCen由两个相互独立的结构域组成，中间由一段弹性螺旋相连。每个结构域都由一对螺旋—环—螺旋结构的EF-hand结构基元组成，每个结构基元能够结合一个Ca2+。与其他物种的中心蛋白一样，在Ca2+存在下，EoCen也会形成多聚体，这一点与CaM明显不同。本文将着重研究金属离子诱导下八肋游仆虫中心蛋白在溶液中的聚集性质。
　　本文用定点突变的方法构建得到了九个酪氨酸突变体(Y46F, Y72F,Y79F, N-Y46F, N-Y72F, N-Y79F, N-Tyr46，N-Tyr72，N-Tyr79)重组质粒。通过DNA序列分析确定所得到的突变体只含有目的位点的突变基因，而不包含其它任何位点的随机突变。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，在诱导剂IPTG诱导下实现蛋白可溶性表达。融合蛋白经PPase酶切和GST亲和层析之后得到目的蛋白。另外，将野生型蛋白(EoCen)和本课题组之前构建完成的蛋白片段分子(N-EoCen，C-EoCen，△23EoCen，P23，P123)诱导表达纯化得到目的蛋白。经SDS-PAGE分析显示所有蛋白均不含杂蛋白条带，达到实验所需纯度。
　　首先对金属离子诱导下的EoCen的聚集性质进行了系统的分析表征。含有不同结构域的蛋白片段分子(EoCen，N-EoCen，C-EoCen，△23EoCen，P23，P123)的化学交联实验表明蛋白的N末端是聚集发生的主要部位。天然胶电泳显示在Lu3+存在下，只有完整的野生型蛋白分子能够显示出多聚体条带。用共振光散射(RLS)的方法分析了多种理化因素，包括温度，蛋白浓度，离子强度，酸度对Lu3+诱导的EoCen聚集性质的影响。不同金属离子与蛋白结合的对照实验表明，Lu3+或Ca2+在EoCen N端的结合有利于蛋白的聚集，且Lu3+表现出更强的促进效应，而Mg2+的结合不能起到相同或相似的作用。2-ptoluidinylnaphthalene-6-sulfonate(TNS)结合实验以及离子强度实验证明Lu3+结合诱导的EoCen的聚集与蛋白疏水区的暴露密切相关。酸度效应实验中，不同片段分子蛋白的对照研究表明静电作用在EoCen的聚集过程中影响较小。
　　酪氨酸残基是组成蛋白——蛋白相互作用的“热点”区域的主要氨基酸残基之一，且其具备发光性质。本课题组之前的工作以Tb3+作为荧光探针证明EoCen存在4个Ca2+结合位点，且Tb3+敏化荧光的增强主要来源于EoCen的N末端所含的三个酪氨酸残基（Tyr-46，Tyr-72，Tyr-79）与结合的Tb3+之间的能量转移。为了找到EoCen聚集时的蛋白——蛋白相互作用过程中，以及EoCen与Tb3+结合时的能量转移过程中起重要作用的酪氨酸残基，本文用定点突变的方法得到了九个分别含有一个或两个酪氨酸残基的EoCen突变体。实验结果显示79位酪氨酸的突变对荧光敏化的影响最为明显，使得Tb3+的荧光敏化强度降低达到50％之多。F(o)rster能量转移机理得出79位酪氨酸与蛋白N端结合的两个Tb3+之间的距离最近(8.8±0.2(A))。稳态荧光及时间分辨荧光参数的测定表明处于疏水环境中的Tyr-79量子产率最高(3.27×10-2)，荧光寿命相对较长(2.20 ns)，且平均寿命数据的标准偏差(σ=0.271 ns)最小。另外，分子模拟显示Tyr-79的酚羟基与Asn-39的侧链上的氧原子之间形成了重要的氢键。酪氨酸与Tb3+的荧光动力学实验证明酪氨酸荧光的猝灭绝大部分来源于EoCen在金属离子结合诱导下产生的聚集，研究发现不同酪氨酸突变体所表现出的荧光猝灭程度有所不同。以全分子单酪氨酸突变体(Y46F，Y72F，Y79F)为研究对象，经RLS和化学交联分析显示，Tyr-79是蛋白聚集过程中贡献最大的酪氨酸残基。
　　细胞渗透型小分子抑制剂Monastrol通常被认为能够特异性地抑制驱动蛋白Eg5的活性，导致细胞有丝分裂停滞和单极纺锤体的形成，从而表现出明显的抗肿瘤活性。中心蛋白作为一种附着于中心体上的广泛存在的蛋白，在中心体复制过程中发挥着重要的作用。已有报道称中心体的大量增殖很可能与癌症有关。本文研究发现Monastrol在体内能够有效抑制转化有pGEX-6p-1-EoCen重组质粒的大肠杆菌细胞的生长，以及八肋游仆虫的增殖分裂;在体外能够抑制Lu3+诱导的EoCen的聚集。合成得到的两个Monastrol类似物（Compound1和Compound2）不能达到相同的抑制效果。荧光滴定实验表明1个EoCen蛋白分子能够结合4个Monastrol分子，并且得到不同温度下EoCen与Monastrol相互作用的结合常数。热力学数据分析显示EoCen与Monastrol结合的主导作用力为疏水作用力。Monastrol对蛋白聚集抑制的程度与金属离子结合所诱导的蛋白疏水区的暴露密切相关。
　　蜂毒素(Melittin)是一种从蜂毒中提取出的由26个氨基酸残基构成的两亲性小分子肽，被广泛用作研究蛋白——蛋白相互作用或者蛋白—脂类相互作用的工具。本文研究表明EoCen与Melittin主要以静电力方式相互作用。初步证明Melittin在EoCen上的结合对Lu3+诱导的EoCen的聚集有抑制作用。中心蛋白的两大作用机制——纤维收缩和信号转导可能存在着共同的分子基础。

目录

创新之处

摘要

第一章 综述

1．1 中心蛋白简介

1．1．1 中心蛋白的功能

1．1．2 中心蛋白的结构

1．2 中心蛋白聚集现象

1．3 本课题研究的意义

第二章 八肋游仆虫中心蛋白突变体的构建、表达和纯化

2．1 引言

2．2 材料

2．2．1 菌种与质粒

2．2．2 寡核苷酸

2．2．3 主要酶及生化试剂

2．2．4 主要试剂的配制

2．2．5 主要仪器设备

2．3 方法

2．3．1 重组质粒(pGEM-T-easy-EoCen)的提取和鉴定

2．3．2 全分子单酪氨酸突变体重组质粒(pGEM-T-easy-M-EoCen)的构建

2．3．3 N-端半分子单酪氨酸突变体重组质粒(pGEM-T-easy-M-N-EoCen)的构建

2．3．4 N-端半分子双酪氨酸突变体重组质粒(pGEM-T-easy-M-N-EoCen’)的构建

2．3．5 融合蛋白的表达

2．4 实验结果

2．4．1 重组质粒(pGEM-T-easy-EoCen)的提取和鉴定

2．4．2 突变重组质粒的酶切鉴定及序列测定结果

2．4．3 重组菌的诱导表达及纯化

2．5 讨论

2．6 结论

第三章 金属离子诱导的八肋游仆虫中心蛋白聚集性质研究

3．1 引言

3．2 材料

3．2．1 主要试剂

3．2．2 主要仪器

3．3 方法

3．3．1 Lu3+储备液的配制

3．3．2 TNS储备液的配制

3．3．3 蛋白储备液的制备

3．3．4 蛋白浓度的测定

3．3．5 天然胶电泳(Native PAGE)分析

3．3．6 荧光共振光散射光谱的测定

3．3．7 荧光发射光谱的测定

3．3．8 蛋白化学交联分析

3．4 实验结果

3．4．1 化学交联分析

3．4．2 天然胶电泳分析

3．4．3 温度对蛋白聚集过程的影响

3．4．4 蛋白浓度对聚集过程的影响

3．4．5 不同金属离子结合对蛋白聚集过程的影响

3．4．6 TNS对蛋白聚集过程的影响

3．4．7 离子强度对蛋白聚集过程的影响

3．4．8 酸度对蛋白聚集过程的影响

3．5 讨论

3．5．1 影响蛋白聚集的因素以及聚集过程中的主导作用力

3．5．2 Self-Assembly的准确定义

3．6 结论

第四章 酪氨酸残基在八肋游仆虫中心蛋白聚集以及荧光共振能量转移中的作用

4．1 引言

4．2 材料

4．2．1 主要试剂

4．2．2 主要仪器

4．3 方法

4．3．1 Tb3+储备液的配制

4．3．2 TNS储备液的配制

4．3．3 蛋白储备液的制备

4．3．4 蛋白浓度的测定

4．3．5 天然胶电泳分析

4．3．6 圆二色谱的测定

4．3．7 荧光寿命的测定

4．3．8 荧光发射光谱的测定

4．3．9 酪氨酸残基与蛋白N端结合的Tb3+之间的F?rster能量转移

4．3．10 动力学测定

4．3．11 分子模拟

4．3．12 荧光共振光散射光谱的测定

4．3．13 蛋白化学交联分析

4．4 实验结果

4．4．1 定点突变对蛋白结构的影响

4．4．2 N-EoCen以及六个突变体蛋白与Tb3+的结合

4．4．3 酪氨酸残基与蛋白N端结合的Tb3+之间距离的计算

4．4．4 蛋白N端半分子双酪氨酸突变体的荧光参数的测定

4．4．5 酪氨酸残基的微环境

4．4．6 TNS检测蛋白的构象变化

4．4．7 蛋白N端半分子单酪氨酸突变体的分子模拟

4．4．8 荧光动力学

4．4．9 蛋白全长分子单酪氨酸突变体的聚集

4．5 讨论

4．5．1 Tyr-79在FRET过程中的重要作用

4．5．2 Tyr-79在蛋白聚集过程中的重要作用

4．5．3 Tyr-72在FRET过程中的作用

4．6 结论

第五章 有丝分裂纺锤体抑制剂Monastrol对八肋游仆虫中心蛋白聚集性质的影响

5．1 引言

5．2 材料

5．2．1 主要试剂

5．2．2 主要仪器

5．3 方法

5．3．1 Lu3+储备液和Tb3+储备液的配制

5．3．2 TNS储备液的配制

5．3．3 蛋白储备液的制备

5．3．4 蛋白浓度的测定

5．3．5 Monastrol及其两个类似物的合成

5．3．6 荧光共振光散射光谱的测定

5．3．7 荧光发射光谱的测定

5．3．8 转化大肠杆菌细胞菌体浓度的测定

5．3．9 八肋游仆虫的培养

5．4 实验结果与讨论

5．4．1 Monastrol对八肋游仆虫增殖分裂的影响

5．4．2 Monastrol对转化大肠杆菌细胞菌体生长的影响

5．4．3 Monastrol对Lu3+诱导的蛋白聚集的影响

5．4．4 Monastrol类似物对Lu3+诱导的蛋白聚集的影响

5．4．5 Monastrol与EoCen结合的主导作用力

5．4．6 Monastrol在EoCen上的结合位点

5．5 结论

第六章 蜂毒素对八肋游仆虫中心蛋白聚集性质影响初步分析

6．1 引言

6．2 材料

6．2．1 主要试剂

6．2．2 主要仪器

6．3 方法

6．3．1 Lu3+储备液的配制

6．3．2 蜂毒素储备液的配制

6．3．3 蛋白储备液的制备

6．3．4 蛋白浓度的测定

6．3．5 荧光发射光谱的测定

6．3．6 荧光共振光散射光谱的测定

6．4 实验结果与讨论

6．4．1 中心蛋白与蜂毒素结合

6．4．2 蜂毒素对Lu3+诱导的蛋白聚集过程的影响

6．5 结论

第七章 总结与展望

7．1 引言

7．2 工作总结

7．3 工作展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间主要发表和待发表的论文

致谢

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