花粉介导法获得转耐盐基因AhCMO玉米植株的研究

摘要

玉米(ZeamaysL.)是世界上三大重要粮食作物之一和首选的饲料作物，在我国占有极其重要的地位，盐碱地是我国重要的土地资源，但玉米的耐盐性相对较差。因此利用植物基因工程技术培育抗旱耐盐的转基因玉米新品种是在盐碱地上种植玉米行之有效的途径之一。本文就此目的开展了两方面的研究:1）利用超声波辅助花粉介导法将山菠菜胆碱单加氧酶基因AhCMO转入玉米自交系‘郑58'中，获得了转基因植株，证明此法在玉米遗传转化中是一种行之有效的方法。2）通过对花粉介导法获得的转基因玉米后代植株进行耐盐性鉴定，结果显示转基因玉米植株的耐盐性普遍高于对照株，且选出2份高耐盐株系。主要研究内容及结果如下:
　　 (1)采用超声波辅助花粉介导法将含有AhCMO基因的载体质粒pBin438导入玉米自交系‘郑58'中，秋季收获T0代转化种子。转化处理植株300株，收获结实株87株，收获玉米籽粒276粒，结实率为29％。T1代植株经卡那霉素抗性筛选及PCR检测获得37株转基因玉米植株。以收获的T0代种子为基数，利用此转化法将CMO基因转入玉米植株的转化率约为13.41％。T1代植株PCR阳性结果率为19.7％;T2代植株的PCR阳性结实率达45％～55％，比T1代明显增加，表明部分转基因植株的目的基因可以遗传给后代，并趋向稳定。
　　 (2)本实验首先利用非转基因玉米植株为材料筛选出鉴定转基因玉米植株耐盐程度的临界盐浓度为250mmol/LNaCl溶液。其后对上述获得的转基因玉米T3代PCR检测阳性结果的玉米植株进行耐盐性鉴定。通过观察其生长状况，测定形态及生理生化指标得出如下结果:
　　 ①形态观察显示:在盐胁迫下，对照植株逐渐表现出叶片发黄、叶片萎蔫直至最后枯萎死亡，而转基因植株在盐胁迫下能够正常生长;且转基因玉米植株的根系比对照株根系庞大。
　　 ②形态指标测定结果显示:在0mmol/LNaCl溶液下转基因植株与对照株的各项形态指标基本无差异;随着处理盐浓度的增加，其生长均受到了一定的影响，但是在同一盐浓度下，转基因植株的各项形态指标均比对照好。在250mmol/LNaCl溶液处理下，转基因株系（除株系N36外）的株高比对照高10.4％-33.6％，鲜重比对照高17.5％-55.2％，干重比对照株高13.6％-82.4％。
　　 ③生理生化指标检测结果显示:在250mmol/LNaCl胁迫下，转基因玉米植株的超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性及叶绿素含量高于非转基因玉米，丙二醛(MDA)含量低于非转基因玉米。SOD活性提高了2％-208％;POD活性提高了22％-65％;叶绿素含量增加了8％-61％;MDA含量减少了3％-93％。依据生理生化指标变化情况建立的耐盐性级别评价方法显示，5份参试株系中耐盐性比对照提高3级的有2份。

目录

摘要

引言

第一章 文献综述

1．1 我国盐碱地现状及治理

1．2 植物抗旱耐盐性机制的研究及进展

1．2．1 植物抗旱耐盐碱研究现状及进展

1．2．2 植物抗旱耐盐机理研究

1．3 植物抗旱耐盐性鉴定评价方法的研究

1．4 植物甜菜碱研究

1．4．1 甜菜碱概述

1．4．2 甜菜碱在植物盐胁迫下的保护作用

1．5 甜菜碱相关酶基因工程研究

1．5．1 甜菜碱醛脱氢酶及其基因工程的研究

1．5．2 胆碱单加氧酶及其基因工程的研究

1．6 植物遗传转化方法研究进展

1．6．1 DNA直接导入转化法

1．6．2 载体系统转化法

1．6．3 种质体系转化法

1．7 本实验的立项依据及研究意义

第二章 超声波辅助花粉介导AhCMO基因转化玉米

2．1 材料

2．1．1 受体材料

2．1．2 供体质粒

2．2 方法

2．2．1 质粒DNA提取方法

2．2．2 转化方法

2．2．3 T1代植株卡那霉素抗性筛选

2．2．4 T1代转化株的PCR检测

2．2．5 T2代种子的获得

2．3 结果与分析

2．3．1 T0代转化株的结实情况统计

2．3．2 T1代植株卡那霉素抗性筛选结果

2．3．3 T1代植株PCR检测结果

2．3．4 T2转基因植株PCR阳性结果率统计

2．4 结论与讨论

2．4．1 结论

2．4．2 讨论

第三章 转AhCMO基因玉米后代的耐盐性鉴定及高耐盐株系的筛选

3．1 试验材料

3．2 试验方法

3．2．1 NaCl鉴定浓度的确定

3．2．2 T3代植株的盐胁迫处理

3．2．3 盐胁迫下转基因植株的苗情观察及形态指标的测定

3．2．4 生理生化指标测定方法

3．2．5 根据生理生化指标检测结果进行植株耐盐性评价的方法

3．2．6 统计分析

3．3 结果与分析

3．3．1 筛选NaCl鉴定浓度

3．3．2 T3代玉米植株PCR扩增检测结果

3．3．3 NaCl溶液胁迫对转基因植株形态指标的影响

3．3．4 NaCl胁迫下抗逆相关生理指标的检测结果

3．3．5 转基因玉米耐盐性级别评价

3．4 结论与讨论

3．4．1 结论

3．4．2 讨论

第四章 研究总结

4．1 总结

4．2 有待于进一步开展的工作

4．3 展望

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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