Substance P抑制高糖诱导的小鼠角膜上皮细胞凋亡的体外实验研究

摘要

目的:
　　体外培养小鼠角膜上皮干/祖细胞系(TKE2)，建立高浓度葡萄糖诱导的小鼠角膜上皮细胞凋亡模型，通过添加substance P(SP)，研究SP对高糖环境下小鼠角膜上皮细胞凋亡的影响，并分析可能的信号通路。
　　方法:
　　1.高糖诱导小鼠角膜上皮细胞凋亡模型的建立:应用小鼠角膜上皮干/祖细胞系(TKE2)作为体外细胞实验的模型，在KSFM培养基中培养TKE2细胞，行如下实验:
　　(1)高糖诱导TKE2细胞凋亡的浓度梯度:TKE2细胞分别采用0、50、150、250、350 mM葡萄糖处理24h，采用Annexin V/PI双染，流式细胞仪检测分析细胞凋亡比例，确定高糖诱导TKE2细胞凋亡的最适葡萄糖浓度。
　　(2)高糖诱导TKE2细胞凋亡的时间梯度:根据(1)中结果选定最适高糖浓度，分别处理TKE2细胞0、12、24、48 h，采用Annexin V/PI双染，流式细胞仪检测分析细胞凋亡比例，确定高糖诱导TKE2细胞凋亡的最适时间。
　　2.SP抑制高糖诱导的TKE2细胞凋亡模型的建立:在方法1结果建立的高糖诱导TKE2细胞凋亡模型中分别添加0.1、1、10μM SP进行预处理2h，采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡，确定SP对TKE2细胞凋亡的影响及其最佳浓度。
　　3.探讨SP抑制细胞凋亡可能的信号通路:根据方法1和2中结果确定高糖浓度、SP浓度及处理时间，分析SP抑制细胞凋亡可能的信号通路:
　　(1)与NK-1R信号通路的关系:在细胞培养过程中，通过添加NK-1R抑制剂L-733，060(1μM)预处理，而后通过Annexin V/PI双染、Caspase活性检测试剂盒检测细胞凋亡情况;
　　(2)与Akt信号通路的关系:在细胞培养过程中，通过添加Akt抑制剂(40μM)预处理，而后行Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡，Western blot检测P-Akt、总Akt的表达。
　　(3)与氧化应激通路的关系:在细胞培养过程中，高糖组中分别添加NAC(1 mM)和DPI(1μM)两种阳性抗氧化剂预处理，与SP组平行实验，而后行ROS染色、钙离子荧光探针(Fluo-3AM)染色和线粒体膜电位荧光探针(JC-1)染色检测分析细胞活性氧水平、细胞内钙离子浓度和线粒体膜电位变化情况。
　　结果:
　　1.HG可诱导TKE2细胞发生细胞凋亡，以晚期凋亡为主，具有浓度和时间依赖性。当葡萄糖浓度分别为0、50、150、250、350 mM时，TKE2细胞凋亡比例分别为5.60％、4.87％、7.97％、44.62％、95.51％。当用相同浓度葡萄糖分别处理0、12、24、48h时，各组细胞凋亡比例分别为6.33％、13.94％、45.11％、66.99％。当葡萄糖浓度为250mM、处理时间为24 h时，TKE2细胞凋亡模型最理想。
　　2.SP可抑制高糖诱导的TKE2细胞凋亡，存在浓度依赖性。当SP浓度分别为0、0.1、1、10μM时，TKE2细胞凋亡比例分别为44.53％、30.23％、16.95％、21.41％。当SP浓度为1μM时，其抑制细胞凋亡的作用最显著。
　　3.SP发挥抑制细胞凋亡可能的信号通路:
　　(1) SP-NK-1R信号通路:向SP组中加入NK-1R抑制剂L-733，060(1μM)后，流式分析结果示HG、HG+SP、HG+SP+NK-1R抑制剂组细胞凋亡比例分别为33.78％、15.68％、34.32％，加入NK-1R抑制剂组细胞凋亡比例较SP组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。caspase3、8、9活性检测结果示:SP组与高糖组相比caspase3、8、9表达均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，SP组中加入Nk-1Ri，caspase8、9表达与SP组无明显差异(P＞0.05)，caspase3表达明显升高，与高糖组无差异(P＞0.05)。
　　(2) Akt信号通路:向SP组中加入Akt抑制剂(40μM)后，流式分析结果示HG、HG+SP、HG+SP+Akt抑制剂组细胞凋亡比例分别为46.70％、15.39％、29.43％，加入Akt抑制剂后，细胞凋亡比例明显高于SP组，但仍低于高糖组，各组差异均有统计学意义(P＜0.01)。Western Blot结果示:高糖组、NK-1R抑制剂组及AKt抑制剂组P-Akt表达水平较对照组及SP组显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.01)，SP组与对照组无差异(P＞0.05)。各组总Akt表达差异无统计学意义(P＞0.05)
　　(3)氧化应激相关通路:高糖处理组中分别加入抗氧化剂NAC和DPI，SP组、NAC组、DPI组与高糖组相比，ROS表达减弱、细胞内钙离子浓度降低，线粒体膜电位升高，各组差异均有统计学意义(P＜0.01)。高糖组、NK-1Ri组、Akti组三组差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论:
　　高浓度葡萄糖可以诱导体外培养的小鼠角膜上皮干/祖细胞系（TKE2）细胞发生细胞凋亡。SP可以抑制高糖诱导的TKE2细胞凋亡。SP抑制细胞凋亡的作用与其通过NK-1R受体，激活Akt信号通路，抑制细胞的氧化应激反应有关。

目录

研究生导师和指导小组成员介绍

声明

摘要

主要符号表

引言

材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

结果

2．1 高糖诱导TKE2细胞发生细胞凋亡存在剂量和时间依赖性

2．2 SP可抑制高糖诱导的TKE2细胞凋亡

2．3 SP抑制高糖诱导的TKE2细胞凋亡相关信号通路

讨论

结论

参考文献

综述 Substance P在调控细胞凋亡中的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢