多西他赛、贝伐单抗和西妥昔单抗不同给药顺序对KRAS野生型肺癌荷瘤小鼠治疗效果的研究

摘要

背景与目的：肺癌是全球范围内主要的癌症死亡原因，发病率和死亡率均呈明显增高趋势。依据生物学行为的差异，临床中通常将肺癌广泛的分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）两大类，其中以NSCLC占大多数，约占所有肺癌病例的80％～85%。多数NSCLC患者在就诊时肿瘤已经发生局部进展或者远处转移，对于此类患者早期多采用化疗进行治疗，但研究表明化疗并不能够改变大多数肺癌患者的远期治疗结局，在化疗上的获益程度已经最大化，换句话说，化疗的疗效已经达到了一个平台期，随着人们对肿瘤分子生物学和基因水平认识的不断深入，分子靶向治疗的研究和临床应用已经成为了人们关注的热点之一。
　　近期研究显示酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）与细胞毒药物以不同的给药顺序应用会对抗肿瘤效果产生明确的影响，由此引起人们对于细胞毒药物与分子靶向药物最佳应用顺序的关注。西妥昔单抗联合化疗作为晚期NSCLC患者一线治疗的临床试验( FLEX)表明，在化疗的基础上联合西妥昔单抗比单用化疗起到更好的延长总生存期（overall survival，OS）的治疗效果。在晚期NSCLC治疗领域，多项临研究(E4599、AVAIL、SAIL等)都证实，在化疗的基础上联合贝伐珠单抗可以延长晚期NSCLC患者的OS以及患者的无进展生存期（progression-free survival，PFS）。但直到目前为止，关于西妥昔单抗、贝伐单抗与细胞毒药物给药顺序的研究仍然较少。目前也尚未见国内外有类似研究的报告。
　　本课题为观察多西他赛、西妥昔单抗和贝伐单抗给药顺序的基础研究，通过选取肺癌细胞株KRAS野生型 H1299细胞荷瘤小鼠作为研究对象，分别以不同顺序给予多西他赛、西妥昔单抗和贝伐单抗，治疗结束后处死小鼠，将移植瘤剥离并测量肿瘤体积，检测肿瘤组织相关蛋白情况，观察多西他赛联合西妥昔单抗序贯贝伐单抗与多西他赛联合贝伐单抗序贯西妥昔单抗对KRAS野生型肺癌荷瘤小鼠的抗肿瘤效果，确定西妥昔单抗与贝伐单抗的最佳应用顺序，为临床合理用药提供理论依据。
　　方法：选择KRAS野生型 H1299细胞进行培养、传代，并以一定数量的细胞进行种瘤。待小鼠皮下肿瘤达到约100~200mm3进行抗肿瘤治疗。按实验设计将小鼠分为8组，即对照组、单药组（TXT、C225、Bev）、两药联合组(Bev+TXT、C225+TXT)和两药联合、单药序贯组（Bev+TXT→C225、C225+TXT→Bev），治疗结束后测量瘤体体积，并应用免疫组化法测定微血管密度（MVD）、Western Blot法测定EGFR、VEGF、Bax、Bcl-2等相关蛋白含量。
　　结果：1.多西他赛、西妥昔单抗和贝伐单抗不同用药顺序对KRAS野生型肺癌H1299细胞裸鼠移植瘤体积的影响：各实验组对比空白对照组对移植瘤体积均有一定抑制作用（P<0.001）。其中以单药C225组、C225+TXT组、C225+TXT→Bev组作用相对明显。单药C225组对移植瘤的抑制作用显著高于单药TXT（P=0.037）和单药Bev（P=0.01），均有统计学意义。然而单药C225组与C225+TXT组、C225+TXT→Bev组比较均无统计学差异（P>0.05）。同时两药联合组（Bev+TXT、C225+TXT）与序贯组（C225+TXT序贯Bev、Bev+TXT序贯C225）以及序贯组组间对比也均无明显差异（P>0.05）。
　　2.免疫组化检测微血管密度（MVD）：各实验组中以单药Bev组微血管密度减少最为明显，但与各组比较无统计学意义（P>0.05）。
　　3.多西他赛、西妥昔单抗和贝伐单抗不同顺序应用于肺腺癌 H1299荷瘤小鼠后，各实验组较空白对照组VEGF均有不同程度升高,但无统计学差异。各实验组Bcl-2蛋白的表达均有所升高，且均显著降低了Bax蛋白的表达， Bcl-2/Bax的比值降低，说明多西他赛、西妥昔单抗和贝伐单抗不同应用顺序均不同程度的抑制血管生成，并通过调节细胞内Bcl-2和Bax表达而诱导细胞的凋亡。
　　结论：单药C225对KRAS野生型H1299裸鼠移植瘤有显著的抑制作用；两药联合不优于单药；不同顺序序贯用药不能显著提高有效率，且两序贯组组间比较无统计学差异。

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前言

对象与方法

1 实验对象

2 实验材料

2.1 试剂

2.2 仪器

3 实验方法

3.1 细胞培养

3.2 动物模型

3.3 免疫组化测定MVD

3.4 Western blot 对相关蛋白表达水平检测

3.5 统计学分析

结果

1.多西他赛、贝伐单抗和西妥昔单抗不同用药对 KRAS 野生型肺腺癌H1299荷瘤小鼠移植瘤生长的影响

2.多西他赛、贝伐单抗和西妥昔单抗不同用药顺序对小鼠移植瘤相关蛋白表达的影响

3.微血管密度（MVD）检测

讨论

1.多西他赛与NSCLC

2. 贝伐单抗与NSCLC

3. 西妥昔单抗与NSCLC

4. 单克隆抗体与细胞毒药物的序贯研究

结果分析

结论

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢