对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的检测及其流行情况初步调查

摘要

本研究针对该病病原对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV),建立了组织病理、核酸探针、PCR及IHHNV与对虾白斑综合征病毒(WSSV)的多重PCR检测技术.其中对携带IHHNV的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织病理学检查发现受感染细胞细胞核内典型的CowdryA(CowdrytypeA)型包涵体,为证实这一结论,本研究根据Genbank登录的IHHNV基因序列(AF218266),设计了一对特异性引物,从纯化的IHHNV DNA和携带IHHNV凡纳滨对虾组织DNA中成功地扩增出产物大小为703bp的DNA片段,该对引物对IHHNV DNA的检测灵敏度为19.85fg(相当于8.83×10<'3>个病毒拷贝),与健康对虾组织DNA、WSSV DNA及对虾肝胰腺细小病毒(HPV)DNA均无交叉反应.在已建立的IHHNV PCR检测方法的基础上利用非放射性标记物地高辛(DIG)制备了DNA探针,通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证.根据对上述建立的各诊断方法检测结果的综合分析,从而确认了本研究采集的凡纳滨对虾样品受IHHNV感染的结论.IHHNV与WSSV的多重PCR反应体系可同时扩增WSSVDNA和IHHNV DNA,且对健康对虾组织DNA及HPV DNA无任何条带出现.该系统对WSSV DNA的检测灵敏度为2.6pg,相当于7.70×10<'3>个病毒拷贝;对IHHNV DNA的检测灵敏度为99.25fg,相当于4.38×10<'4>个病毒拷贝.比单—PCR检测灵敏度低10倍.为消除实验室核酸污染,将中国对虾白斑综合征病毒(WSSV)病毒液分别与万福金安含氯消毒剂、高锰酸钾、甲醛、过氧化氢、甲酚皂、酒精和氯仿作用.不同浓度消毒剂与病毒液作用不同时间后提取DNA作病毒核酸斑点杂交检测.应用PCR检测技术对2001-2004年我国沿海部分养殖地区对虾及其饵料和环境生物携带IHHNV及WSSV情况进行了调查,调查结果显示,在281份被检对虾样品包括凡纳滨对虾、细角滨对虾(Litopenaeus stylirostris)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)和日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus))中,IHHNV携带的对虾品种均为凡纳滨对虾,阳性率达54.8％,幼虾(Juvenile)和仔虾(Postlarvae)样品携带IHHNV的阳性比率较高;饵料和环境生物卤虫(Artemia)、沙蚕(Nereidae)、轮虫(Rotatoria)、桡足类(Copepoda)、绒螯近方蟹(Hemigrapsuspenicillatus))的检测结果显示绒螯近方蟹样品呈IHHNV阳性;日本对虾、凡纳滨对虾和绒螯近方蟹中均可检出WSSV,阳性率为40.9％,幼虾和成虾携带WSSV的阳性比率较高.本研究结果首次发现在自然状态下养殖凡纳滨对虾和蟹类可同时携带IHHNV和WSSV两种病毒.证实我国养殖凡纳滨对虾确实携带有IHHNV,在自然状态下该病毒能否在我国其它养殖对虾品种和环境生物中传播并流行,及其在我国的分布情况和造成的危害需进一步跟踪、调查.

目录

文摘

英文文摘

第一章 综述

1对虾病毒性疾病研究进展

1.1引言

1.2对虾主要病毒性疾病病原特性

1.3对虾主要病毒性疾病的诊断

2对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)研究概况

2.1引言

2.2 IHHNV的病毒特性及分类地位

2.3 IHHNV感染宿主及传播途径

2.4 IHHNV地理分布及其致病性

2.5疾病的诊断方法

2.6常规诊断技术

2.7分子生物学诊断技术

2.8疾病防治

参考文献

第二章对虾传染性皮下及造血组织坏死病(IHHN)病理学观察

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1组织病理观察

2.2细胞病理观察

3讨论

第三章 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)和白斑综合征病毒(WSSV)PCR检测技术的建立及病毒流行情况初步调查

第一节对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)PCR检测方法的建立

1材料与方法

2结果

3讨论

第二节对虾白斑综合征病毒(WSSV)PCR技术

1材料与方法

2结果

3讨论

第三节消毒剂对对虾白斑综合征病毒(WSSV)DNA作用效果的比较

1材料与方法

2结果

3讨论

第四节对虾及其饵料和环境生物样品携带WSSV及IHHNV情况调查

1材料与方法

2结果

3讨论

第五节多重PCR检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)及传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)

1材料与方法

2结果

3讨论

第四章 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)核酸探针检测技术的建立

第一节对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)核酸探针斑点杂交

1材料与方法

2结果

3讨论

第二节对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)原位杂交

1材料与方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

附 录

在读期间已发表的论文

本研究拟整理待发表论文

致谢