利用核糖体工程技术开拓海洋微生物药用新资源的研究

摘要

在微生物的筛选过程中，95％的菌株在现有筛选模型下不显示任何生物活性的菌株。如何有效合理利用这些菌株，是众多学者关注的问题。本文利用核糖体工程技术对这些菌株二次开发，对开拓海洋微生物药用新资源的方法学进行了探讨。 本实验以一株没有抗肿瘤活性的海洋放线菌玫瑰黄链霉菌为出发菌株，采用引入抗生素(氯霉素，链霉素)抗性的方法，即核糖体工程技术，进行诱导突变，共获得有抗生素抗性的突变株270株。突变株的菌落形态、孢子颜色以及代谢产物与母体菌株有显著的差异。对突变株的发酵产物利用小鼠乳腺癌细胞tsFT210，以细胞周期抑制、细胞凋亡诱导及坏死性细胞毒活性为指标，进行活性筛选，共获得有显著抗肿瘤活性的突变株3株。 对其中一株活性较好的突变株Str3054进行大量发酵，采用活性追踪的方法对其发酵产物的活性成分进行初步分离，共获得6个单体化合物；利用波谱学方法阐明了其中5个化合物的结构，分别为：邻苯二甲酸二异丁酯，丁烯二酸二-2-乙基正己酯(Z，R，R)，次黄嘌呤核苷，尿嘧啶核苷，环(Pro-Gly)二肽；其中丁烯二酸二-2-乙基正己酯(Z，R，R)为新化合物。利用tsFT210细胞镜检，流式细胞术和SRB法对化合物进行活性评价，其中4个化合物表现出一定的坏死性细胞毒活性，1个化合物表现为细胞周期抑制活性。 对该菌株突变前后的核糖体S12蛋白编码的基因rpsL进行PCR扩增表达，将表达产物转入大肠杆菌DH5a，进行测序。比较菌株突变前后的rpsL序列差别，发现该段基因并没有发生点突变，推测可能存在其它突变位点影响该菌株的链霉素抗性，寻找新突变点的研究有待于进一步深入。该测序结果通过GenBank的查找，与StreptomycesfilamentosusS12蛋白对应的rpsL基因有97％的相似度，证明本实验克隆得到的序列正是rpsL基因。 综上，本文利用核糖体工程技术首次对没有抗肿瘤活性的海洋放线菌进行诱变，得到具有显著抗肿瘤活性的突变株。对该突变株的代谢产物进行初步研究，得到具有抗肿瘤活性的单体化合物，实验结果证实了利用该方法开拓海洋微生物药用资源的可行性。 利用核糖体工程技术对自然界的无活性微生物进行诱导，激活微生物潜在的基因资源来获得活性菌株，该方法的成功应用将极大的拓展微生物药用新资源。

目录

摘要

前言

1.核糖体工程的提出

2.目前的研究现状

3.本文的立题

第一章抗肿瘤活性细胞筛选模型及活性测试方法

1.1实验材料

1.1.1细胞系

1.1.2实验仪器

1.1.3实验试剂

1.2实验方法

第二章具抗生素抗性的活性菌株的获得

2.1材料和方法

2.2结果与分析

2.2.1菌株B3054对氯霉素及链霉素的MIC

2.2.2抗性菌株的获得

2.2.3抗性菌株中，抗肿瘤活性菌株的筛选

2.3小结

第三章活性菌株Str3054的发酵生产

3.1材料和方法

3.2结果与分析

3.2.1发酵条件的确定

3.2.2活性部位的考察结果

3.2.3溶剂萃取试验结果

3.2.4活性组分的稳定性实验

3.2.5生产发酵及活性组分的获得

3.3小结

第四章Str3054代谢产物的活性追踪分离

4.1实验材料、仪器及试剂

4.2化合物的分离

4.3化合物的结构鉴定

4.4小结

第五章化合物生物活性测试

5.1材料和方法

5.2化合物生物活性测试结果

5.2.1酯类化合物的生物活性

5.2.2核苷类化合物的生物活性

5.2.3其他化合物的生物活性

5.3小结

第六章抗性菌株Str3054的rpsL基因分析

6.1 DNA的提取与纯化

6.1.1材料

6.1.2方法

6.1.3结果

6.1.4讨论

6.2 PCR扩增目标DNA

6.2.1 PCR引物的设计以及反应条件

6.2.2确定PCR的反应最适混合物

6.2.3 PCR制备目标DNA以及DNA的纯化

6.3目的DNA的克隆表达——目的DNA转入pMD18-T

6.3.1材料

6.3.2方法

6.3.3结果

6.4基因测序以及序比较

6.4.1材料

6.4.2步骤

6.4.3结果

6.5小结

结语

创新与特色

致谢

参考文献

附图