胁迫因子对杜氏藻（Dunaliella）生长及其β-胡萝卜素积累的影响研究

摘要

盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)在人工控制和胁迫条件下，能大量积累β-胡萝卜素(占干重的10～14％)，被公认为是生产β-胡萝卜素的理想天然资源。早在1966年，Massyuk就提出杜氏藻可作为产品化的β-胡萝卜素的来源。杜氏藻还含有约40％的蛋白质，其氨基酸组成与植物蛋白相似，可用作动物饲料蛋白源。杜氏藻在适宜的条件下具有很高的生物量产量，最高可达15-20g/(m2·d)，大规模生产的平均水平亦可达到10-15g/(m2·d)，高于大多数其它藻类的产量，因此，杜氏藻是一种很好的单细胞蛋白源。甘油是重要的有机化工原料，目前主要从石油中提取，其售价在3～5美元/Kg，但随石油资源的耗尽，其价格不断上涨，利用杜氏藻生产甘油具有潜在的发展前景。大量积累甘油的杜氏藻种类，在适当的条件下，其甘油含量可达干重的50％。综合提取胡萝卜素和甘油，可使甘油生产成本降至0.752美元/Kg，低于石油生产甘油的成本(0.88美元/Kg，1980年价格)。另外，杜氏藻有很宽的盐度适应范围，D.salina可在1％～35％的盐度范围内生长，是自然界最耐盐的真核生物之一，它是生物学工作者研究生物机体对高渗环境适应机制的模式生物。有鉴于此，美国、澳大利亚、以色列、日本、西班牙、加拿大等国较早就开展了杜氏藻的形态、生理、生态和医学研究并投入生产和工业化养殖。我国具有漫长的海岸线(18000Km)和星罗棋布的内陆盐湖(仅1Km2以上的就有500多个)，具有培养杜氏藻生产β-胡萝卜素得天独厚的自然条件。C、N、P、Fe源及pH值是影响杜氏藻生长的重要环境因子之一，明确杜氏藻对不同营养盐的吸收规律和杜氏藻生长的二阶段对营养盐种类和浓度的不同要求对优化杜氏藻培养基，提高生长速度，促进杜氏藻和β-胡萝卜素产业的发展有重要意义。本文研究了乙酸、C、N、P比例、氮盐、铁盐、磷盐、盐度、碳盐对杜氏藻(Dunaliella)生长、色素积累和生化组成的影响，建立了杜氏藻对主要营养盐吸收利用的动力学方程，并研究了杜氏藻对氨((NH4)2CO3)毒性的耐受性。 主要结果是：●对D.salina，乙酸调节pH值可明显促进生长。细胞密度最大值120×104cell/mL(pH≤8.5)，β-胡萝卜素最大值102mg/g(pH≤8.0)，叶绿素a含量达到104mg/g(pH≤8.5)，三者与对照组相比均有显著差异。乙酸调节pH值还可以提高单不饱和脂肪酸18：1和多不饱和脂肪酸18：2ω6的含量。蛋白含量随pH升高而提高；对D.parva，乙酸调节pH值对生长无明显促进作用，也不能提高β-胡萝卜素含量，但明显提高叶绿素a含量，最大值达144mg/g(pH≤9.0)，还可提高蛋白含量，达到33.5％(pH≤9.0)。 ●D.salinaOUN04最大细胞密度114.2×104cell/mL、最大β-胡萝卜素含量100.4mg/g、最大叶绿素a含量144.6mg/g分别出现在C、N、P比例为12/1/0.05、12/2/0.1、12/1/0.05的处理组中，且均与对照组差异显著。不同C、N、P比例对D.salinaOUN04主要脂肪酸(16：0、18：1、18：2ω6)组成有显著影响；对D.salinaOUN04蛋白含量也有显著影响，最大蛋白含量32.44％出现在6/1/0.05的处理组中，但与对照组(31.46％)差异不显著；D.salinaOUN05最高细胞密度101.2×104cell/mL、最高β-胡萝卜素含量109.2mg/g、最大叶绿素a含量108.7mg/g分别出现在C、N、P比例为6/2/0.05、6/0.5/0.1、12/2/0.1的处理组中，且均与对照组有显著差异。最大蛋白含量34.41％出现在6/1/0.05的处理组中，但与对照组(33.17％)差异不显著。 ●D.salinaOUN07生长最合适的氮源是尿素(0.75mmol/L)，最大细胞密度为105×101cell/mL，对照组仅为59×104cell/mL(p＜0.05)；最高β-胡萝卜素含量(110.6mg/g)出现在NH4NO3/尿素复合肥(0.125mmol/0.125mmol)中，但与对照组(109.4mg/g)差异不显著；较低的氮盐有利于β-胡萝卜、素的积累。1.0mmol/L尿素培养的D.salinaOUN07叶绿素a含量最高(48.5mg/g)，但与对照组(48.1mg/g)差异不显著；较高的氮盐有利于叶绿素a的合成。藻液pH值最初5天急剧上升，随后2-3天有所下降，最后几天波动较大。最大pH值(9.92)出现在NH4NO3/尿素复合肥(0.25mmol/0.25mmol)中。 ●D.salinaOUN04生长最适的Fe(柠檬酸铁)浓度为0.05mmol/L(最大细胞密度111.5×104cell/mL)，其次为0.01mmol/L(细胞密度100×101cell/mL)。对照组为82.9×104cell/mL。0.25mmol/LFe组细胞密度(70×101cell/mL)最低，说明高浓度Fe对杜氏藻生长有抑制作用。最大β-胡萝卜素含量(83.2mg/g)出现在0.25mmol/LFe浓度组中，其次为0.05mmol/L组(75.8mg/g)，对照组(63.4mg/g)最低。Fe浓度为0.25mmol/L时有最大的叶绿素a含量(98.4mg/g)，其次为0.01mmol/L组(89.5mg/g)，对照组为8.0.2mg/g。前6天藻液pH值急剧上升，7-12天波动较大，pH最大值为10.38(对照组)。Fe浓度测定结果表明，开始1-3天，Fe吸收较慢，4-7天吸收加快，后又变慢。并建立了杜氏藻对Fe吸收的动力学方程。D.salinaOUN09生长最快的Fe浓度为0.05mmol/L(最大细胞密度131×104cell/mL)。对照组密度为118.5×104cell/mL。0.25mmol/LFe组密度(102.3×104cell/mL)仍最低。最大β-胡萝卜素含量为130.2mg/g(0.05mmol/LFe组)，对照组为70.4mg/g。叶绿素最大值为64.2mg/g(0.05mmol/LFe组)，对照组为37.4mg/g；pH值变化和Fe的吸收情况与D.salinaOUN04相似。 ●细胞生长最快的的KH2PO4浓度是0.10mmol/L，最高密度为118×101cell/mL，无磷对照组密度最低；β-胡萝卜素积累量最高的KH2PO4浓度是0.10mmol/L，其次是0.05mmol/L；0.10mmol/L浓度组的磷在7天内吸收完毕，磷在培养液中残存的时间与其最初的施用浓度呈正相关关系；浓度过大(超过0.15mmol/L)对细胞生长和分裂及β-胡萝卜素积累有抑制作用，浓度越高，抑制作用越大；细胞培养的前6-7天，藻液pH值有明显的上升趋势，随后3-4天又下降。本研究还在试验的基础上建立了藻液中活性磷被盐生杜氏藻吸收的量与培养时间之间的函数关系。 ●在实验盐度范围(30，60，90，120，对照)内，较低的盐度对细胞生长、β-胡萝卜素积累、叶绿素a合成都很有利，也可提高细胞蛋白含量，处理细与对照组差异显著(p＜0.05)。 ●12mmol/L的NaHCO3对D.salina生长最合适，细胞最高密度为84.6×104cell/ml，对照组仅为36.7×104cell/ml；在实验范围内，β-胡萝卜素含量随NaHCO3浓度的升高而增加，15mmol/L组有最高的β-胡萝卜素含量104.6mg/g，对照组仅为60.8mg/g；叶绿素a最大含量135mg/g也出现在15mmol/L组；建立了NaHCO3吸收的动力学方程。 ●在实验范围(0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8g/L)内，细胞存活率随(NH1)2CO3剂量的增加和处理时间的延长而下降，12h半致死剂量为0.6g/L；施加(NH)2CO3后，藻液pH值迅速升高，最高达9.38，随后12h逐渐下降，1248h继续下降，但降速较慢；施加(NH4)2CO3后，出现细胞死亡、变形、溃烂、沉淀，程度随(NH4)2CO3剂量的增加和处理时间的延长而增加。本实验结果和我们的实践经验认为，在杜氏藻大规模生产中，可用0.6g/L的(NH4)2CO3处理藻液4h或0.3g/L处理6-8h来抑制变形虫、游仆虫等原生动物造成的污染。本研究论文的创新点在于率先进行了乙酸对杜氏藻(Dunaliella)生长和β胡萝卜素积累影响的研究并首次研究了C、N、P比例对盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)生长和细胞生化组成影响。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

第二章环境因子对杜氏藻(Dunaliella)生长、β-胡萝卜素积累和生化组成的影响

第一节乙酸对两种杜氏藻(Dunaliella)生长和细胞生化组成的影响

第二节盐度对盐生杜氏藻(Dunaliella salina)生长和色素积累的影响

第三节pH值对盐生杜氏藻(Dunaliella salina)生长和β-胡萝卜素积累的影响

讨论

第三章营养盐对杜氏藻(Dunaliella)生长、β-胡萝卜素积累和生化组成的影响

第一节不同氮源对盐生杜氏藻(Dunaliella salina)生长和β-胡萝卜素积累的影响及氮源吸收规律的比较研究

第二节活性磷对盐生杜氏藻(Dunaliella salina)生长和β-胡萝卜素积累的影响

第三节碳源对盐生杜氏藻(Dunaliella salina)生长和色素积累的影响

第四节不同氮源对盐生杜氏藻生长和细胞生化组成的影响

第五节C、N、P比例对两株盐生杜氏藻(Dunaliella salina)生长和生化组成的影响

第六节两种杜氏藻(Dunaliella)对硝酸盐利用模型的比较

第七节Fe对两株盐生杜氏藻(Dunaliella salina)生长和色素积累的影响

第八节盐生杜氏藻(Dunaliella salina)对(NH4)2CO3的耐受性

讨论

参考文献

结束语

致谢