中国地方绵羊品种PRNP基因研究

摘要

绵羊PRNP的多态性与绵羊对痒病的易感性有关，特别是PRNPl36，154和171位点。从我国lO省份采集了24个我国主要地方绵羊品种的血液样品668份，提取绵羊基因组DNA，用PCR方法扩增绵羊PRNP基因，通过序列测定，对它们的PRNP基因多态性进行分析，以确定PRNP的多态性情况以及这些绵羊品种对痒病的感染风险。研究发现了PRNP编码区21、85、101、112、127、138、141、143、146、153、154、171和189一共13位点的基因多态性，其中21、85和143位点的多态性为首次发现。值得注意的是，在本次研究中没有发现136位点丙氨酸(A)／缬氨酸(V)的多态性，136位点均为纯合的A。而154位点精氨酸(R)／组氨酸(H)的多态性与先前的研究一致，H的多态性也比较少。在171位点发现了谷氨酰胺(Q)，R，H或赖氨酸(L)四种多态性变化。由于易感等位基因ARQ的等位基因频率高达78.14％，所以调查的羊群对于感染痒病均存在较高的风险。 根据绵羊PRNP因序列设计了针对407、461、512和513位点SNP多态性的上下游引物和探针，建立了检测绵羊PPdV／q136、154、171位点基因型的TaqMan探针Real-time PCR方法。本方法用于检测绵羊PRNP基因型具有简便快速，结果直观，容易判读等优点，可以用于大量绵羊样品的PRNP瑾因分型，适合于在大部分具有标准设备的分子生物学实验应用。用本方法检测了200份藏羊的PRNP基因型，结果发现藏羊的PRNP基因型主要为ARQ／ARQ，其次为ARQ／ARR，还有少量的ARQ／VRQ，ARQ／AHQ基因型。 根据Genbank中绵羊PrP基因全序列和表达载体pET28a载体和pFMDHZ—α—A的多克隆位点设计了针对绵羊PrP前体蛋白基因引物，以绵羊基因组DNA为模板，PCR扩增绵羊PrP前体蛋白基因，通过酶切、连接，将本基因克隆到原核表达载体pET28a(+)和真核表达载体pFMDHZ—α—A中，构建了重组原核表达载体pET28a—OPrP和真核酵母重组表达载体pFMDHZ—α—A—OPrP。将重组质粒pET28a—OPrP转化E. cOli BL一2l感受态细胞，用IPTG诱导表达。将重组质粒pFMDHZ—α—A—OPrP经电转化转入多形汉逊酵母中，随后通过甲醇诱导进行表达。通过PAGE电泳和Western-blot鉴定表达的绵羊PrP前体重组蛋白。为TSE的检测及诊断、PrP的结构与功能研究奠定基础。

目录

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本方所用缩略语

摘要

前言

第一章文献综述

第二章中国主要地方绵羊品种PRNP基因多态性研究

第三章绵羊ARQ基因型PrP前体蛋白基因的克隆及表达

总结

参考文献

附录

致谢

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