产琼胶酶菌株Agarivorans albus QM38的发酵条件优化、酶的分离纯化及酶学性质研究

摘要

利用生物技术向海洋索取药物和功能性食品的研究日益受到人们的重视。近年来，随着糖生物学的深入研究，人们发现琼胶寡糖具有诱导细胞调亡、抑制NO、抗氧化、抗炎、促进双歧杆菌生长、预防糖尿病等多种生理功能。利用琼胶酶水解琼胶生产琼胶寡糖的技术被认为是当今最理想的绿色环保生产技术。但由于琼胶酶来源少、活性低、价格昂贵，难于用于琼胶寡糖的生产，因此，筛选研究产琼胶酶高活性菌株和酶的发酵生产具有重要的实际意义。 本研究筛选得到了具有较高琼胶酶活力的菌株Agarivorans albus QM38，对其液体发酵产酶条件进行了优化，提高了产酶能力，为进一步放大发酵规模奠定了基础。对该菌株的发酵液进行了酶的分离纯化，制得了两种高活性的琼胶酶，进行了酶的性质分析和酶解琼胶的产物分析，为高活性琼胶酶的生产和应用提供了一定理论基础和实验依据。 运用单次单因素试验与正交实验相结合的方法对菌株的发酵产酶条件进行了优化，将该菌株的最佳产酶条件确定为：琼胶0.5％，NaCl3.0％，尿素0.2％，酵母粉0.1％, MgSO40.05％, K2HPO40.1％, FeSO40.002％,,Fe2(SO4)30.001％, CaCl20.02％；发酵培养条件为：30℃，150rpm/min，接种量1.0％，培养36h后发酵液酶活达到最高，为56.58U/mL。 在优化后的培养条件下对菌株进行发酵培养。发酵液经低温离心、硫酸铵盐析、冷冻干燥后得到粗酶粉。将粗酶粉进行Native-PAGE、酶活性染色，确定了该菌株发酵产生的蛋白中至少三个具有琼胶酶活力。 采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Sephacryl S-100凝胶过滤层析等纯化步骤进行了酶的分离纯化。获得两种酶活力峰经SDS-PAGE均显示为一条带，分别命名为琼胶酶A、琼胶酶B。两种酶分别纯化了17.61及15.44倍，收率分别为15.21％和7.27％。酶的性质研究表明，琼胶酶A和B的相对分子量分别为127.8kDa和92.83kDa。其中琼胶酶A的相对分子量高于目前已有报道的所有琼胶酶。琼胶酶A的最适反应温度为35℃，相对于B较为不耐热；酶B的最适反应温度为55℃，且有较好的耐热性。酶A与B的最适反应pH都偏碱性，与目前报道的多数琼胶酶特性相似。对两种酶的最适底物浓度实验表明，酶B的最适反应底物浓度高于A，为1.2％，估计酶B更适于降解凝胶态琼胶。多数二价金属离子对两种酶都有抑制作用，0.5mmol/L的Fe3+几乎可以完全抑制A、B两种酶的活性。 本实验中的两种琼胶酶都具有较好的底物专一性，对实验涉及的除琼胶外的其他多糖均无降解作用。用琼胶酶A水解琼胶制备琼胶寡糖的结果经质谱分析表明，产物主要为四糖和六糖，另有少量二糖。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1琼胶及其结构

1.2琼胶酶及其分类

1.2.1琼胶酶及其来源

1.2.2琼胶酶的分类

1.2.3琼胶酶的作用机制

1.3琼胶酶的应用

1.3.1制备琼胶低聚糖和琼胶寡糖

1.3.2作为海藻遗传工程的工具酶

1.3.3在分子生物学研究方面的应用

1.3.4用于海藻多糖的结构研究

1.4琼胶酶的分子生物学研究进展

1.5展望

第二章高产琼胶酶菌株Agarivorans albus QM38的发酵条件优化

2.1实验材料与仪器设备

2.1.1菌种与试剂

2.1.2仪器设备

2.2实验方法

2.2.1菌株的培养及形态观察

2.2.2 Agarivorans albus QM38产酶条件的研究

2.3实验结果

2.3.1 Agarivorans albus QM38平板培养的菌落形态及降解圈观察

2.3.2碳源对产酶的影响

2.3.3氮源种类及其浓度对产酶的影响

2.3.4 NaCl浓度对产酶的影响

2.3.5培养基的起始pH对产酶的影响

2.3.6装瓶量对产酶的影响

2.3.7接种量对产酶的影响

2.3.8培养温度对产酶的影响

2.3.9产酶条件的正交试验

2.3.10最优培养条件下菌株产酶的酶活力—时间曲线

2.4小结

第三章琼胶酶的分离纯化与性质研究

3.1实验材料与仪器设备

3.1.1试验试剂：

3.1.2主要仪器设备

3.1.3发酵培养基成分（%，W/N）及发酵培养条件

3.2实验方法

3.2.1琼胶酶粗酶的制备

3.2.2琼胶酶粗酶中酶组分的鉴定

3.2.3琼胶酶的纯化

3.2.4蛋白质浓度的测定

3.2.5琼胶酶的活力测定

3.2.6琼胶酶的纯度鉴定及相对分子量的测定

3.2.7琼胶酶理化性质的研究

3.3实验结果

3.3.1琼胶酶粗酶的制备

3.3.2琼胶酶粗酶的酶活性鉴定

3.3.3琼胶酶的纯化

3.3.4琼胶酶的纯度鉴定及相对分子量的测定

3.3.5琼胶酶理化性质的研究

3.4小结

3.4.1琼胶酶的分离纯化

3.4.2琼胶酶的性质

第四章琼胶酶A用于琼胶寡糖的制备及分析

4.1实验材料与仪器设备

4.1.1材料

4.1.2试剂

4.1.3仪器设备

4.2实验方法

4.2.1还原糖浓度的测定

4.2.2酶解产物的制备

4.2.3酶解产物的分析

4.3实验结果

4.4小结

总结

参考文献

致谢

个人简历