皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino.)L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(GLO)的研究

摘要

本论文首先介绍了脊椎动物维生素C合成关键酶--L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(GLO)研究进展,包括脊椎动物中GLO的性质,影响脊椎动物GLO活性的因素,GLO在脊椎动物中的存在、分布以及与脊椎动物进化的关系。然后,通过分子生物学手段,围绕皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino.)是否具有GLO活性,是否具有VC合成能力这一主题进行了研究。主要研究内容包括:(1)皱纹盘鲍GLO基因的克隆和组织及不同发育阶段的表达;(2)饲料维生素C对皱纹盘鲍成鲍生长、各组织抗坏血酸含量以及GLO mRNA表达量的影响;(3)皱纹盘鲍VC缺乏条件下肝胰腺和肾脏差异表达cDNA文库的构建。研究结果总结如下:
　　 (1)皱纹盘鲍GLO基因的克隆和组织及不同发育阶段的表达。配制VC0.0 mg/kg的精制饲料,在室内流水养殖系统中,投喂初重为74.32±0.43 g,初始壳长为84.36±0.24 mm的皱纹盘鲍成鲍,养殖周期170天。以肾脏组织mRNA为模板,通过简并引物PCR法克隆GLO核心片段,通过RACE法调取基因全长。通过特异引物PCR和荧光实时定量PCR法确定皱纹盘鲍不同组织和不同发育阶段的表达。结果如下:获得了皱纹盘鲍GLO cDNA全长序列,包括1606个核苷酸,其中开放阅读框包括1365个核苷酸,编码一个由454个氨基酸组成的蛋白质,其氨基酸序列与脊椎动物的GLO序列有很高的同源性(＞48％),确定其为皱纹盘鲍GLO基因;GLO mRNA在包括肝胰腺、肾脏、外套膜、肌肉、鳃和血细胞等6个组织中都有表达;Glo mRNA在从担轮幼虫到幼鲍的7个发育阶段都有表达,并且相对表达量在上足分化幼虫中达到最高,呈现随幼体发育先升高后下降的趋势。本研究在国际上首次从无脊椎动物中克隆到GLO全长序列,证明皱纹盘鲍具有VC合成能力。
　　 (2)饲料维生素C对皱纹盘鲍成鲍生长、各组织抗坏血酸含量以及GLO mRNA表达量的影响。配制VC 0.0,70.3,829.8和4967.5 mg/kg的共4个水平的精制饲料,在室内流水养殖系统中,投喂初重为74.32±0.43 g,初始壳长为84.36±0.24 mm的皱纹盘鲍成鲍,养殖周期170天。结果表明,饲料中不同VC含量对皱纹盘鲍成鲍的存活率,增重率,贝壳日增长率等生长指标没有显著影响(p＞0.05)。皱纹盘鲍不同组织间抗坏血酸含量存在极显著差异(p＜0.01),鳃在各处理组均极显著的高于其他各组织(p＜0.01);而血清除在70.3mg/kg处理组显著低于外套膜(p＜0.05)外,其他均极显著的低于其他组织(p＜0.01);总体而言,皱纹盘鲍组织抗坏血酸含量为鳃＞肾脏、肝胰腺＞外套膜、肌肉＞血清。饲料中不同添加水平的维生素C对皱纹盘鲍各个组织抗坏血酸含量产生不同的影响,对肾脏、外套膜、鳃和血清抗坏血酸含量没有显著影响(p＞0.05);而对肌肉和肝胰腺抗坏血酸含量产生显著影响(p＜0.05):当饲料中维生素C含量达到4967.5 mg/kg时,肌肉中的抗坏血酸含量极显著的高于0.0 mg/kg处理组(p＜0.01),显著高于829.8 mg/kg处理组(p＜0.05);肝胰腺中的抗坏血酸含量显著高于0.0 mg/kg处理组(p＜0.05)。不同组织中两种看家基因β-actin和核糖体蛋白S9 mRNA的表达量均存在极显著差异(p＜0.01),总体而言,β-actin mRNA的表达量血细胞＞鳃、肌肉、外套膜、肾脏＞肝胰腺;核糖体蛋白S9 mRNA的表达量鳃＞血细胞、外套膜、肾脏、肝胰腺＞肌肉。不同饲料维生素C对皱纹盘鲍β-actin mRNA的表达量在肝胰腺、肾脏、肌肉和外套膜中不受饲料维生素C含量的影响(p＞0.05),但在鳃和血细胞中受饲料维生素C含量的影响(p＜0.05);核糖体蛋白S9 mRNA的表达量在肝胰腺、肾脏、肌肉、外套膜和鳃中均无显著影响(p＞0.05)。以核糖体蛋白S9为内参基因时,饲料维生素C对各组织中GLOmRNA相对表达量均没有影响(p＞0.05);以β-actin为内参基因时,除鳃之外的其他各组织中GLO mRNA相对表达量均不受饲料维生素C的影响(p＞0.05);在鳃中,0.0mg/kg处理组显著高于829.8mg/kg处理组(p＜0.05)。各组织间GLOmRNA相对表达量存在极显著差异(p＜0.01),总体而言,GLO mRNA相对表达量肾脏＞鳃＞血细胞、外套膜、肝胰腺＞肌肉。
　　 (3)皱纹盘鲍VC缺乏条件下肝胰腺和肾脏差异表达cDNA文库的构建。配制了维生素C缺乏(0 mg/kg)和正常(4967.5 mg/kg)2个水平的精制饲料,在室内流水养殖系统中,投喂初重为74.32±0.43 g,初始壳长为84.36±0.24 mm的皱纹盘鲍成鲍,养殖周期170天。采用抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH),构建了维生素C缺乏条件下肝胰腺和肾脏组织差异表达cDNA文库。消减杂交效率分析显示,构建的2个差异表达cDNA文库中差异表达的基因分别至少被富集了2 5和2 5-10倍。从文库中随机挑选阳性克隆测序。在肝胰腺差异表达cDNA文库中,获得了63个基因片段。在肾脏差异表达cDNA文库中,获得了39个基因片段。这些片段有可能为VC缺乏条件下差异表达的基因,这些片段的获得为进一步从分子水平研究皱纹盘鲍VC代谢机理奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章:脊椎动物维生素C合成关键酶——L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶研究进展

1.1 引言

1.2 脊椎动物中的L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶的性质

1.3 影响脊椎动物L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶活性的因素

1.3.1 物种差异

1.3.2 性别及发育阶段的差异

1.3.3 季节的影响

1.3.4 食物中抗氧化剂的含量的影响

1.4 L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶在脊椎动物中的存在、分布及与脊椎动物进化的关系

1.5 小结和展望

1.6 参考文献

附图

第二章:皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino.)L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(GLO)基因的克隆和组织及不同发育阶段的表达

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.2.1 实验饲料

2.2.2 养殖实验管理

2.2.3 样品的采集和处理

2.2.4 L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(GLO)基因的克隆和序列分析

2.2.5 L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(GLO)组织及不同发育阶段的表达

2.3 结果

2.3.1 所提取的肾脏组织总RNA和分离的mRNA质量检验

2.3.2 GLO核心片段克隆结果

2.3.3 GLO 3'RACE结果

2.3.4 GLO 5'RACE结果

2.3.5 GLO全长序列和结构分析

2.3.6 多序列比对和系统进化树分析

2.3.7 皱纹盘鲍不同组织GLO的表达

2.3.8 皱纹盘鲍不同发育阶段GLO的表达及mRNA相对表达量

2.4 讨论

2.5 结论

2.6 参考文献

附表

第三章:饲料维生素C对皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino.)成鲍生长、各组织抗坏血酸含量以及L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(GLO)mRNA表达量的影响

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 实验饲料

3.2.2 养殖实验管理

3.2.3 样品的采集和处理

3.2.4 样品分析

3.2.5 统计分析

3.3 结果

3.3.1 生长指标

3.3.2 饲料维生素C对皱纹盘鲍体组织抗坏血酸含量的影响

3.3.3 饲料维生素C对皱纹盘鲍L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(GLO)mRNA表达量的影响

3.4 讨论

3.5 结论

3.6 参考文献

附表

第四章:皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)维生素C缺乏条件下肝胰腺和肾脏差异表达消减cDNA文库的构建

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.2.1 实验饲料

4.2.2 养殖实验管理

4.2.3 样品的采集和处理

4.2.4 消减cDNA文库的构建

4.3 结果

4.3.1 肝胰腺和肾脏组织总RNA的提取及mRNA分离

4.3.2 双链cDNA的合成及Rsa Ⅰ消化分析结果

4.3.3 Adaptors连接分析

4.3.4 PCR产物分析

4.3.5 消减杂交效率分析

4.3.6 差异片段阳性克隆的筛选和测序

4.4 讨论

4.5 结论

4.6 参考文献

附表

致谢

个人简历