大菱鲆(Scophtha imus maximus)体细胞培养及其在病毒研究中的应用

摘要

海水养殖行业具有较大的发展前途和经济价值，近年来发展非常迅速。大菱鲆作为名贵养殖品种，养殖面积不断扩大。但是由于海水污染的日益加剧和养殖密度的不断增大，大菱鲆各种传染病尤其是病毒病连年爆发，大菱鲆大量死亡，给大菱鲆养殖业带来了巨大的经济损失。病毒病爆发迅速，死亡率高，难于防治。大菱鲆细胞系作为研究相关病毒的侵染途径和机制以及探索病毒病的防治方法的有效途径，对于研究大菱鲆病毒病防治，具有重要意义。但是目前，国内外仅建立了少数几个大菱鲆细胞系分散于几个实验室，这远远不能满足大菱鲆病毒学、毒理学、免疫学、生理学，遗传学和种质保存等理论研究以及抗病毒途径等应用研究的需要。目前这种情况对亟需解决的大菱鲆病毒病研究非常不利。因此迫切需要建立大菱鲆细胞系支持本实验室实验研究。
　　 本文以透明质酸酶和Ⅱ型胶原酶联合消化大菱鲆鳍组织进行原代培养，并优化培养液配方和培养条件。发现大菱鲆鳍条细胞的最适宜培养基是Leibovitz-15;当温度在20～24℃时，大菱鲆鳍条细胞生长良好；发现pH7.2为大菱鲆鳍细胞的最适生长pH值。24℃，pH7.2时，培养于含有20％的胎牛血清(FBS)、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和10ng/ml表皮生长因子(ECF)的L-15培养基中的大菱鲆鳍条组织块在原代培养2周后，即可观察到明显的生长晕，细胞形态饱满，为成纤维细胞样形态，生长分裂旺盛，于组织块周围呈放射状排列。原代培养20天后可长成单层。
　　 大菱鲆鳍条细胞长成单层后，以0.25％胰蛋白酶消化传代。实验表明，培养于含有20％的胎牛血清(FBS)、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和10ng/ml表皮生长因子(ECF)的L-15培养基中的大菱鲆鳍条细胞以1/2进行传代，3-5d可长成单层。经液氮冻存和复苏后仍保持有原有形态和较高存活率，目前已传至30代以上。第30代细胞在贴壁生长的前1d处于迟缓期，第2-4d处于对数生长期，第5-6d则基本处于平稳期。群体倍增时间为50.7h。染色体分析发现，第30代大菱鲆鳍条细胞染色体数目分布在26-58之间，其中44条的细胞占总细胞的75.97％。
　　 提取编码WSSV主要囊膜蛋白VP28的基因序列，插入载体pEGFP-N1质粒中，构成pEGFP-N1-VP28，使用LipofectamineTM2000对第25代大菱鲆鳍条细胞进行转染，24小时后荧光显微镜观察，大菱鲆鳍条细胞中产生荧光，pEGFP-N1-VP28获得表达。本株细胞可以用于病毒蛋白的真核表达。
　　 本文中还进行了大菱鲆、圆斑星鲽、欧鳎以及中国对虾部分组织的原代培养探索。包括：大菱鲆脾脏、肾脏、心脏、肠道，圆斑星鲽的鳍条，心脏、脾脏，欧鳎的鳍条、心脏、肾脏，中国对虾血细胞和肝胰腺细胞。鳍条采用透明质酸酶和胶原蛋白酶联合消化后组织块接种法培养。大菱鲆脾脏、肾脏、心脏、肠道，圆斑星鲽心脏、脾脏，欧鳎的心脏、肾脏，采用组织块法培养，中国对虾血细胞离心收集血细胞后培养，中国对虾肝胰腺细胞采用消化法培养。所有组织在两周内均可以迁出细胞和生长，但是生长速率各不相同。其中大菱鲆肝脏和圆斑星鲽脾脏原代培养后尝试传代，圆斑星鲽脾脏细胞传至第六代。中国对虾血细胞可存活一周以上，肝胰腺细胞可存活两天。

目录

文摘

英文文摘

谨献

第一章 文献综述

1 鱼类细胞培养概况

1.1 细胞培养概况

1.2 水生动物细胞培养概况

1.3 世界鱼类细胞培养概况

1.4 我国鱼类细胞培养概况

2 鱼类细胞培养的应用

2.1 鱼类细胞培养技术在病毒学的应用

2.2 鱼类细胞培养在细胞遗传学中的应用

2.3 鱼类细胞培养在毒理学中的应用

2.4 鱼类细胞培养在免疫学中的应用

2.5 鱼类细胞培养在内分泌学中的应用

2.6 鱼类细胞培养在活性物质制备中的应用

2.7 鱼类细胞培养在资源保护研究中的应用

2.8 鱼类细胞培养在鱼类肿瘤研究中的应用

2.9 鱼类细胞培养在鱼类生理学上的研究

第二章 大菱鲆鳍条细胞原代培养

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 大菱鲆鳍细胞最适宜培养液的确定

3.2 大菱鲆鳍条细胞最适宜培养条件的确定

4 讨论

5 小结

第三章 大菱鲆鳍条细胞传代培养

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 传代培养的大菱鲆鳍条细胞

3.2 大菱鲆鳍细胞系的生长特性

3.3 FBS对细胞生长影响

3.4 大菱鲆鳍细胞的冻存与复苏

3.5 大菱鲆鳍细胞系的染色体分析

4 讨论

5 小结

第四章 大菱鲆鳍条细胞的初步应用

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 VP28目的片段的PCR扩增

3.2 pEGFP-N1-VP28质粒转染大菱鲆鳍条细胞荧光照片

4 讨论

第五章 其他水产养殖动物组织的原代培养探索

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 圆斑星鲽组织培养

3.2 欧鳎组织培养

3.3 大菱鲆组织培养

3.4 中国对虾组织培养

4 讨论

参考文献

发表的学术论文

个人简历

致谢