栉孔扇贝(Chlamys farreri)性别分化相关基因的筛选以及两个相关基因的表达分析

摘要

性别分化是发育生物学研究的重要内容之一,性别分化相关基因的研究在脊椎动物特别是哺乳动物中较为深入,目前已经发现了Sry、Sox9、Wnt4等诸多与性别决定和分化有关的基因；但在无脊椎动物特别是海洋贝类中相关的研究尚处于起步阶段。本研究选取我国重要的水产经济贝类——栉孔扇贝(Chlamysfarreri)为研究对象,采用Solexa测序技术对其增殖期精卵巢的差异表达谱进行了分析,获得了295262个在精卵巢中差异表达的Tag,其中1354个Tag可以在GenBank数据库中得以注释。选择其中的5条核酸序列进行了半定量RT-PCR验证,发现solexa测序结果与半定量结果的一致率为40％。
　　 采用RACE技术对其中的CL3256序列进行全长cDNA扩增,序列比对初步判定其为核糖体蛋白24基因,定名为Cf-rlp24。该基因全长cDNA为965 bp,开放阅读框为525 bp,编码175个氨基酸,该推测蛋白在不同物种之间同源性很高。Real-time PCR检测Cf-rlp24基因在精、卵巢之间以及不同发育时期的精巢中均存在表达差异,其中生长期和成熟期精巢Cf-rlp24基因的表达量显著高于相应时期的卵巢,分别高出2.200±0.446倍和6.036±1.283倍；在精巢的发育过程中,该基因的表达呈逐渐升高的态势,至成熟期时达最高值,而后迅速回落；但在卵巢的发育过程中,始终处于较低的表达水平,且未见该基因的显著性表达差异。我们得出,Cf-rlp24基因参与栉孔扇贝性腺的发育,且在精巢发育中的作用大于卵巢。
　　 本研究我们还采用Real—time PCR技术,分析了栉孔扇贝卵黄蛋白原基因(Cf-vtg)在两性性腺发育周期以及肝胰腺中的表达,得出该基因主要在卵巢中表达,且其表达量随着卵巢的发育成熟而逐渐升高,生长期和成熟期Cf-vtg基因的表达量分别为增殖期的1.917±0.035和2.570±0.252倍。休止期卵巢该基因几乎没有表达。进一步我们发现Cf-vtg基因在肝胰腺中也有少量的表达,其表达量为增殖期卵巢中的0.045±0.009。该基因在精巢中几乎没有表达。进一步我们采用注射的方法,检测了17β-E2对扇贝Cf-vtg基因的诱导表达,real-time PCR结果显示,17β-E2可明显诱导Cf-vtg基因的表达。因此推测17β-E2可以促进栉孔扇贝扇贝Cf-VTG的合成。