节旋藻色基裂合酶基因cpcS,cpcT,cpcU的克隆及在有光学活性藻蓝蛋白β亚基生物合成中的功能研究

摘要

钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)是一种具有很高营养价值的经济微藻,其富含藻蓝蛋白,藻蓝蛋白具有抗氧化,抗肿瘤等作用,还可作为一种天然色素,广泛用于医药、食品、化妆等行业,此外由于其所特有的荧光活性且无毒,还可用作荧光标记物及光动力治疗等领域。近年来,通过基因工程手段表达具有光学活性藻蓝蛋白研究取得了较多的成果,为有光学活性藻蓝蛋白的应用及构建新的光合系统提供了基础。
　　光学活性藻蓝蛋白的合成过程中重要的一步是藻蓝胆素与脱辅基蛋白的共价偶联,而藻蓝胆素与脱辅基蛋白的正确连接需要特定的色基裂合酶的催化。光学活性藻胆蛋白的生物合成一般需要脱辅基藻蓝蛋白(CpcA,CpcB),色基合成酶(Hox1,PcyA),色基裂合酶三种元件的共同参与。本实验室前期关于节旋藻藻蓝蛋白α亚基的色基裂合酶的研究已经比较完整,但是还没有关于节旋藻藻蓝蛋白β亚基色基裂合酶的研究,因此本论文克隆了节旋藻藻蓝蛋白β亚基的色基裂合酶,并研究了其功能。
　　本论文首次克隆了钝顶节旋藻A. platensis FACHB314的色基裂合酶基因cpcS,cpcT和cpcU,其中cpcS全长594bp,编码197个氨基酸序列,分子量为22.1kDa,blastp比对其属于CpeS superfamily,存在5个保守结构域,分别是THHL,ENH,LRERGYAEI,YETM和ERF,氨基酸序列的同源比对结果显示与其他蓝藻的序列相似度为72.52％;cpcT基因全长597bp,编码198个氨基酸残基,等电点为5.29,分子量为22.8kDa,blastp比对其属于CpeT superfamily,具有FSN,NPP,AHI,RPL,EQAY,PYR和FKG七个保守结构域,氨基酸序列的同源比对结果显示与其他蓝藻的序列相似度为71.14%;cpcU基因全长525bp,编码174个氨基酸残基,等电点为5.30,分子量为19.2kDa,blastp比对其属于CpeS superfamily,具有7个保守域,分别是EFF,SAGKWFS,GKS, EER,PNLR,ASF和SEIR,氨基酸序列的同源比对结果显示与其他蓝藻的序列相似度为73.22%。
　　为了研究节旋藻的色基裂合酶CpcS,CpcT和CpcU在藻蓝蛋白β亚基与藻蓝胆素结合过程的作用,本实验构建了3个重组表达载体:pACYCDuet-cpcB-cpcS(含有藻蓝蛋白β亚基基因cpcB和色基裂合酶 cpcS基因), pACYCDuet-cpcB-cpcT(含有藻蓝蛋白β亚基基因cpcB和色基裂合酶cpcT基因)和pACYCDuet-cpcB-cpcU(含有藻蓝蛋白β亚基基因cpcB和色基裂合酶cpcU基因),并将这3个载体和pACYCDuet-cpcB(仅含有藻蓝蛋白β亚基基因cpcB)分别与pET24-hox1-pcyA(含有色基合成酶hox1和pcyA基因)一起转入大肠杆菌BL21中,构建重组表达菌株BS,BT,BU和B,并诱导蛋白表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测蛋白的表达情况,荧光光谱检测重组蛋白的荧光强度,结果显示重组菌株中均表达出了藻蓝蛋白,而且有色基裂合酶存在的菌株比没有色基裂合酶的菌株表达的藻蓝蛋白的荧光强度高,而且荧光发射峰更接近天然藻蓝蛋白,说明色基裂合酶对光学活性藻蓝蛋白β亚基的合成具有一定的催化作用。
　　为了进一步研究这三个色基裂合酶在藻蓝蛋白β亚基上的作用位点,通过将节旋藻藻蓝蛋白β亚基82位和153位的半胱氨酸分别进行突变,突变成丙氨酸,构建突变菌株B(C82A)S,B(C153A)S,B(C82A)T,B(C153A)T,B(C82A)U和B(C153A)U。通过比较突变菌株与未突变菌株表达的藻蓝蛋白的荧光强度来分析色基裂合酶的作用位点。结果显示,突变菌株B(C82A)T与未突变菌株BT的单位质量藻蓝蛋白的荧光强度基本保持一致,而突变菌株B(C153A)T的单位质量藻蓝蛋白荧光强度比未突变菌株要低,因此推断色基裂合酶CpcT的作用位点是β亚基153位的半胱氨酸;而突变菌株B(C153A)S与未突变菌株BS相比,单位质量藻蓝蛋白的荧光强度基本没有变化,而突变菌株B(C82A)S的荧光强度发生下降,因此推断裂合酶CpcS的作用位点为β亚基82位的半胱氨酸;突变菌株B(C153A)U与未突变菌株BU相比,单位质量藻蓝蛋白的荧光强度基本没有变化,而突变菌株B(C82A)U的荧光强度发生下降,因此推断裂合酶CpcU的作用位点也为β亚基82位的半胱氨酸。
　　本研究首次克隆并研究了节旋藻中藻蓝蛋白β亚基色基裂合酶CpcS,CpcT和CpcU的功能,为阐明节旋藻中有光学活性藻蓝蛋白的生物合成机制,人工合成有光学活性藻蓝蛋白奠定了基础。

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第一章 前言

1 藻胆体的结构与组成

2 藻胆蛋白

3 光学活性藻胆蛋白的生物合成

4藻蓝蛋白的制备

5 本文的立项依据和研究意义

第二章 节旋藻色基裂合酶基因cpcS，cpcU 和cpcT的克隆与序列分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 节旋藻cpcS, cpcU, cpcT基因在表达有荧光活性的藻蓝蛋白β亚基中的功能研究

1.材料与方法

2. 实验结果与分析

3.讨论

第四章 色基裂合酶CpcS、CpcT、CpcU对藻蓝蛋白β亚基作用位点的研究

第一节 CpcS作用位点的研究

第二节 CpcT作用位点的研究

第三节 CpcU作用位点的研究

第四节 讨论

全文总结

参考文献

致谢

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