化学表观遗传修饰法研究海葵来源月状旋孢腔菌代谢产物多样性初探

摘要

在本实验室前期的工作中,从一株海葵来源真菌 Cochliobolus lunatus(TA26-46)中分离得到了一系列十四元大环内酯类化合物,显示了良好的生物活性,如抗真菌活性和抗藤壶幼虫附着活性。本研究主要对真菌C. lunatus(TA26-46)进行化学表观遗传修饰,试图提高该菌次级代谢产物的结构多样性,为后续生物活性及构效关系研究提供化合物基础。
　　在前期研究基础上,考察不同的发酵条件对真菌C. lunatus(TA26-46)产生十四元大环内酯类化合物的影响。通过改变培养基成分(固体大米培养基、GPY培养基、淀粉培养基、组成型培养基等)、添加前体(乙酸钠、丙二酸钠)、加入代谢关键酶抑制剂(细胞单氧化酶抑制剂美替拉酮、聚酮合酶抑制剂碘乙酰胺)等,发现该菌代谢稳定。其中,固体寡营养培养条件下,次级代谢种类多产量少,HPLC中色谱峰分离效果明显,若代谢存在变化易于检测,因此可选用该培养条件作为后续表观修饰用初始培养条件。液体培养培养条件下,该菌产生大环内酯化合物种类单一,发酵时间短,采用正交试验法进行发酵条件优化,大环内酯化合物LL-Z1640-2的产量达到119.76 mg/L,提高产量3.6倍。
　　采用表观遗传修饰剂对真菌C. lunatus(TA26-46)进行表观遗传修饰。选择组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠和辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA),添加到培养基中进行发酵培养。添加丁酸钠后,从发酵产物中分离得到6个大环内酯类化合物,分别为:5-Bromozeaenol(1),3,5-Dibromozeaenol(2),aigialomycin B(3),zeaenol(4),LL-Z1640-1(5)和 LL-Z1640-2(6)。其中化合物(1–2)为首次发现的天然溴代大环内酯类化合物,通过CD光谱和化学转化法确定了其绝对构型。添加SAHA也得到了相同溴代大环内酯类化合物,表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导该菌产生溴代大环内酯类化合物。
　　选择DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷,添加到培养基中进行发酵培养。在5-氮杂胞苷的影响下,大环内酯类化合物仍然是该菌的主要代谢产物,但其次级代谢发生了较大变化。除大环内酯类化合物外,从发酵物中分离到11个邻苯二甲酸一缩二乙二醇酯类化合物,分别为:Diethylene glycol phthalate ester A(7),1,2-Benzenedicarboxylic acid,1,2-bis[2-(2-hydroxyethoxy) ethyl] ester(8),1,2-Benzenedicarboxylic acid, oxydi-2,1-ethanediyl dimethyl ester(9),Diethylene glycol phthalate ester B(10),1,2-Benzenedicarboxylic acid,1,1′-(oxydi-2,1-ethanediyl)2,2′-bis[2-(2-hydroxyethoxy) ethyl] ester(11),Diethylene glycol phthalate ester C(12),1,2-Benzenedicarboxylic acid,1,2-bis[2-[[2-[[2-(2-hydroxyethoxy) ethoxy] carbonyl] oxy] ethoxy] ethyl] ester(13), Diethylene glycol phthalate ester D(14),Diethylene glycol phthalate ester E(15), Diethylene glycol phthalate ester F(16),Diethylene glycol phthalate ester G(17)。其中7、10、12、14、15、16、17为新化合物。
　　采用抗菌、抗藤壶幼虫附着、斑马鱼鱼毒等活性模型,对分离获得的化合物进行了活性评价,发现,大环内酯类化合物zeaenol(4), LL-Z1640-1(5)和LL-Z1640-2(6)对藤壶幼虫(Balanus amphitrite)附着具有抑制作用,EC50值分别为5.0μg/mL,5.0μg/mL和1.82μg/mL;溴代大环内酯类化合物未显示抗藤壶附着活性。所测试化合物未发现其他活性。
　　综上所述,本研究运用化学表观遗传修饰的方法,对海葵来源真菌C. lunatus(TA26-46)进行操作,发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂可诱导产生溴代大环内酯类化合物;DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷未显著影响大环内酯类化合物的产生,但诱导产生了邻苯二甲酸一缩二乙二醇酯类化合物。通过化学表观遗传修饰从该真菌发酵产物中发现9个新化合物,其中2个为首次获得的天然溴代十四元大环内酯类化合物。化学表观遗传修饰为获得新颖结构大环内酯等化合物探索了一种有效的方法。

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前言

3.1基于化学表观遗传修饰发现新的化合物

3.2基于改变培养条件 (OSMAC) 发现新化合物

3.3基于共培养的方法发现新化合物

3.4基于分子水平基因操作的手段发现新化合物

第一章：海葵来源真菌Cochliobolus. lunatus（TA26-46）的发酵优化

1引言

2实验部分

2.1试验样品

2.2不同培养基不同培养方式对菌株次级代谢的研究

2.3不同前体及酶抑制剂对菌株次级代谢产物的研究

2.4目标化合物LL-Z1640-2的发酵优化

3结果与讨论

3.1培养基及培养条件对菌株次级代谢产物的影响

3.2前体及酶抑制剂对菌株次级代谢产物的影响

3.3目标化合物LL-Z1640-2发酵优化结果

4.小结

第二章 真菌Cochliobolus lunatus (TA26-46)化学表观遗传修饰研究

1引言

2试验部分

2.1组蛋白去乙酰化酶抑制剂对菌株次级代谢产物的研究

2.2 DNA甲基化转移酶抑制剂对菌株次级代谢产物的研究

2.3化合物活性测试

3实验结果与讨论

3.1组蛋白去乙酰化酶抑制剂对菌株次级代谢的影响

3.2 DNA甲基化转移酶抑制剂对菌株次级代谢的影响

3.3化合物活性测试结果

4小结

结论与创新点

研究展望

参考文献

附图

致谢

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