海洋巨大芽孢杆菌抑制黄曲霉毒素生物合成及其机制

摘要

黄曲霉是粮食作物在生长和贮存过程中存在的一种主要真菌。黄曲霉会产生毒性极强的黄曲霉毒素，影响人类和动物的健康，对农业、商业都产生极大的影响，并具有致癌、致突变、免疫抑制、致畸形等作用。世界各国投入了大量的人力和物力致力于黄曲霉毒素的降解等相关技术研究。生物防治的方法由于高效率、环境污染小、效果显著而更受青睐。本研究利用从海洋中分离出的巨大芽孢杆菌抑制黄曲霉生长及黄曲霉毒素产生，并采用基因芯片分析的方法来检测抑制黄曲霉形成黄曲霉毒素的基因表达途径，这对降低黄曲霉毒素含量的研究具有重要意义。
　　(1)分别在UF715133-1和Jinhua1012两种花生仁上接种海洋巨大芽孢杆菌和黄曲霉共培养，测定海洋巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素的生物合成和基因表达的影响。提取黄曲霉毒素并用HPLC分析毒素含量，再用KEGG和qRT-PCR对基因进行分类和分析。结果表明，在实验组Jinhual012和UF715133-1中，超过85％的黄曲霉毒素B1合成被抑制，还有一些编码蛋白酶的基因，如短链脱氢酶、非核糖体多肽合成酶等显著下调。因此，从海洋中分离出的巨大芽孢杆菌可显著抑制黄曲霉毒素在花牛仁上的合成，黄曲霉中多种基因的表达受到抑制，但这些基因在黄曲霉毒素生物合成中的作用尚未阐明，其作用机制还有待进一步深入研究。
　　(2)分别在PDB和MM两种液体培养基，接种海洋巨大芽孢杆菌与黄曲霉共培养，测定海洋巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素的生物合成和基因表达的影响。提取黄曲霉毒素并用HPLC分析毒素含量，再用KEGG和qRT-PCR的方法对基因进行分类和分析。结果表明，在PDB培养基和MM培养基中培养的黄曲霉，所累积的黄曲霉毒素几乎完全（分别减少99.75％和99.80％）被海洋巨大芽孢杆菌抑制了，生物量也分别比对照组生物量减少81.15％和74.67％。说明通过与海洋巨大芽孢杆菌共培养抑制了黄曲霉的生长，同时也抑制黄曲霉毒素的产生。基因芯片数据显示，在PDB和MM培养基实验组，CPA生物合成的相关基因表达下调。
　　(3)本实验从黄曲霉DNA选取3段探针，分别在5'端进行生物素标记，DNA探针长度大约为400bp。海洋巨大芽孢杆菌在37℃摇床培养24小时进行增殖;再以高速离心收集上清液，经旋转蒸发仪蒸发浓缩，用冷冻干燥器干燥，得到的粗提蛋白与PCR扩增后的生物素标记DNA探针相互作用，在非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行凝胶电泳，后经电泳转移，采用化学发光EMSA试剂盒，对BiotinDNA-蛋白质用化学发光底物检测，确定结合位点。结果表明，探针3与海洋巨大芽孢杆菌代谢产物结合并出现迁移阻滞，探针3（aflS5'端）与海洋巨大芽孢杆菌结合后的EMSA条带发生迁移，探针3的DNA序列是与海洋巨大芽孢杆菌蛋白的结合位点所在，且这种反应是特异性结合。由此证明，海洋巨大芽孢杆菌代谢产物结合到aflS基因的启动子位置，使aflS不能转录，从而阻断黄曲霉毒素的生物合成。

目录

声明

摘要

0 文献综述

0．1 黄曲霉及黄曲霉毒素的危害

0．1．1 黄曲霉

0．1．2 黄曲霉毒素分子结构及理化性质

0．1．3 黄曲霉毒素的危害

0．1．4 黄曲霉毒素污染造成的损失状况

0．2 黄曲霉产生毒素及其机制

0．2．1 黄曲霉毒素生物合成过程及相关基因

0．2．2 黄曲霉毒素在体内的代谢途径

0．3 黄曲霉毒素脱毒技术研究

0．3．1 物理脱毒法

0．3．2 化学脱毒法

0．3．3 生物降解脱毒法

0．4 黄曲霉毒素的检测方法

0．4．1 薄层层析法(TLC)

0．4．2 高效液相色谱法(HPLC)

0．4．3 酶联免疫吸附测定法(ELISA)

0．4．4 其他方法

0．5 研究内容及意义

0．5．1 研究意义

0．5．2 研究内容

1 花生中巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素生物合成相关基因的抑制

1．1 引言

1．2 实验材料与仪器

1．2．1 实验材料

1．2．2 实验仪器

1．3 实验内容及方法

1．3．1 在花生上接种海洋巨大芽孢杆菌和黄曲霉

1．3．2 黄曲霉毒素的提取和HPLC分析

1．3．3 基因芯片

1．3．4 RNA分离和基因芯片分析

1．3．5 途径分析

1．3．6 定量RT-PCR

1．3．7 统计分析

1．4 结果与分析

1．4．1 在花生品种Jinhua 1012和UF 715133-1中黄曲霉基因差异表达

1．4．2 KEGG注释和分析

1．4．3 qRT-PCR分析

1．4．4 基因芯片结果分析

1．4．5 其他控制黄曲霉毒素合成基因

1．5 小结

2 液体培养基中巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素生物合成相关基因的抑制

2．1 引言

2．2 实验材料和仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 在液体培养基中接种海洋巨大芽孢杆菌和黄曲霉

2．3．2 黄曲霉毒素的提取和HPLC分析

2．3．3 基因芯片

2．3．4 RNA分离和基因芯片分析

2．3．5 途径分析

2．3．6 定量RT-PCR

2．3．7 统计分析

2．4 结果和分析

2．4．1 海洋巨大芽孢杆菌影响黄曲霉次级代谢产物途径基因表达

2．4．2 在PDB和MM的液体培养基，海洋巨大芽孢杆菌对真菌生长和黄曲霉毒素B1生物合成的影响

2．4．3 在PDB和MM培养基中海洋巨大芽孢杆菌对黄曲霉基凶表达的影响

2．4．4 KEGG注释和分析

2．4．5 aRT-PCR分析

2．4．6 基因芯片结果分析

2．4．7 其他控制黄曲霉毒素合成基因

2．4．8 黄曲霉毒素生物合成中Afls和AflR作用的模型

2．5 小结

3 电泳迁移率实验(EMSA)分析巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素生物合成中aflS和aflR的作用

3．1 引言

3．2 实验材料与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 EMSA探针的选取

3．3．2 黄曲霉DNA抽提

3．3．3 PcR扩增及琼脂糖电泳

3．3．4 粗提海洋巨大芽孢杆菌代谢产物

3．3．5 EMSA及化学发光法检测

3．4 结果和分析

3．4．1 PCR扩增结果

3．4．2 粗提海洋巨大芽孢杆菌代谢产物

3．4．3 化学发光测定EMSA结果

3．5 小结

4 结论与展望

4．1 研究结论

4．2 研究展望

参考文献

致谢

个人简历

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