蓝光诱导转录因子NgAUREO1对酿酒酵母细胞大小调控机理及转基因酵母发酵能力的初步研究

摘要

转录因子是一类能够识别基因启动子区的顺式作用元件并与之特异性地结合，对基因转录有激活或抑制效应的蛋白质分子，从分子水平上调控生物体的多种生理活动。目前对转录因子的研究多集中在陆生生物中，水生生物研究的较少，尤其是海洋微生物。2007年，日本工作者从海洋不等鞭毛藻类—无隔藻属中发现了一类新型转录因子，受到外界环境中蓝光的调控，命名为aureochromes(AUREOs)，其由发挥转录因子功能的bZIP结构域和接受蓝光信号的LOV结构域组成。蓝光照射能够使LOV构象发生变化随后引起bZIP构象的变化，从而调控bZIP结构域与DNA结合的紧密性，影响基因的表达。目前已从海带、海链藻、长囊水云、金藻等多种海洋藻类中发现了该转录因子，但对其功能了解较少。
　　本文从微拟球藻（Nannochloropsis gaditana）转录组数据库中获得了编码另一AUREO的部分基因序列，命名为NgAUREO1。经RACE扩增获得其全长为2086bp，其中包括162bp的5'端非编码区、490bp的3'端非编码区以及1434bp的编码区，并成功导入了酿酒酵母细胞进行真核表达。获得的阳性克隆在显微镜下观察发现，与野生酵母细胞相比，重组酵母细胞变大;利用流式细胞仪分析重组酵母细胞中平均DNA和蛋白含量，结果表明，重组酵母中平均DNA含量由16提高到18.3、平均蛋白含量由3.75提高到6.28，进一步说明重组酵母细胞体积发生了明显变化。从影响酵母细胞大小的重要方面—细胞周期调控网络入手，分析NgAUREO1对酵母细胞大小的作用机理，根据AUREO识别并结合DNA核心序列(TGACGT)的特点，筛选了6个与细胞周期相关的基因(Pho85，Pho80，Pah1，Hsp12，Ies5和Bck2)。利用荧光定量PCR技术分析基因表达情况，经分析发现，有4个基因表达发生了显著变化，其中Pho85，Pho80和Pah1的表达量提高、Bck2表达量降低。因此，我们推断NgAUREO1可能通过调节细胞周期进程影响细胞大小。
　　另外。本实验还对重组酿酒酵母的发酵能力进行了初步研究，对发酵48h的重组酵母和野生酵母的产乙醇能力进行测定，结果表明重组酵母具有较高的产乙醇能力，乙醇产量由野生酵母的9.68％增加到11.59％(v/v)。对重组酵母的发酵条件以及重要营养因子进行了优化，获得重组酵母以葡萄糖作为碳源，蛋白胨+酵母粉（质量比1∶2）作为混合氮源以及在初始pH值6.0、接种量6％、培养温度30℃、转速220 r/min等条件下最适于生长。
　　本研究加深了对AUREOs的功能性认识，为AUREOs应用于基因改造，实现外界光调理生物体内基因表达奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 转录因子

1．1 转录因子的结构

1．2 转录因子的分类及相关功能

1．3 转录因子在基因工程中的应用

1．4 人工转录因子

1．5 转录因子研究方法

2 蓝光调控性转录因子Aureochromes(AUREOs)

2．1 AUREOs的结构特点

2．2 AUREOs的功能特点

2．3 AUREOs潜在应用—光遗传学

3 细胞大小调控因素—细胞周期

3．1 酵母细胞周期中两关键检测点的作用机制

3．2 周期蛋白依赖激酶(CDKs)活性调节

3．3 细胞周期网络对酵母细胞大小调控的分子机理

4 生物质能乙醇的研究现状

4．1 高性能发酵酵母的选育与改造

4．2 酵母发酵技术及工艺

5 本课题立项依据及研究内容

第二章 微拟球藻NgAUREO1基因的克隆及真核表达

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与讨论

2．1 微拟球藻总RNA质量检测

2．2 微拟球藻NgAUERO1全序列获得

2．3 重组表达载体pAUR123-AUREO1的构建

2．4 真核表达微拟球藻NgAUERO1基因

3 小结

第三章 NgAUREO1调控酿酒酵母细胞大小机理研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与讨论

2．1 转基因酿酒酵母细胞的基本特征

2．2 流式细胞仪分析细胞DNA和蛋白含量

2．3 NgAUREO1和细胞周期相关基因的转录表达分析

2．4 蓝光对转NgAUREO1酵母细胞的细胞周期相关基因的影响

3 小结

第四章 转基因酵母发酵能力初步研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与讨论

2．1 转基因酵母与野生酵母发酵能力

2．2 转基因酵母发酵条件的优化

2．3 转基因酵母营养因子的优化

3 小结

全文总结

参考文献

致谢

个人简历

硕士期间发表的学术论文及研究成果