雨生红球藻优良藻株的诱变选育及其培养基的氮磷浓度的优化

摘要

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种单细胞绿藻，在胁迫条件下能够大量积累虾青素，具有较高的经济价值。虾青素具有显著的着色能力，并能够抗癌变、抗氧化、抗紫外线辐射及增强免疫力等，在保健品、化妆品、医药、水产养殖等领域具有广阔的发展前景。在规模化培养雨生红球藻生产虾青素的过程中，优良藻株的诱变选育一直是研究的重点和热点。诱变选育出生长速度快、虾青素含量高的藻株在工业生产中具有较强的实用意义。
　　为了提高雨生红球藻的生物量和虾青素含量，本研究采用了紫外线诱变的方法。以雨生红球藻株(H0)为出发藻株，根据致死率，确定了紫外照射的最适时间为8min。经过诱变、筛选和对藻株性能的检测，获得了两株生物量和虾青素含量都较高的突变藻株H7和H11。与出发藻株比，突变株的生长速度提高了18.9％和17.0％，虾青素含量提高了9.0％和4.5％。
　　在选育了优良藻株的基础上，本论文对雨生红球藻培养基中氮源的种类、最适浓度，以及磷源的最适浓度进行了研究。通过比较硝酸钠、碳酸氢铵和氯化铵对雨生红球藻生长的影响，发现雨生红球藻的适宜氮源为硝酸钠，适宜的浓度为1.0g/L。雨生红球藻在含1.0g/L硝酸钠的培养基中连续培养12天，生物量可以达到4.85×105cell/ml，培养结束后，虾青素可以有效积累，含量达到3.49％。磷的最适浓度为0.04g/L，在最适磷浓度下，连续培养12天，生物量可以达到5.9×105cell/ml，诱变15天后，虾青素含量达到3.82％。最后通过正交实验得到，NaNO3浓度、K2HPO4·3H2O浓度、pH分别为0.8g/L、0.04g/L、7的配方利于雨生红球藻的生长，NaNO3浓度、K2HPO4·3H2O浓度、初始pH分别为0.4g/L、0.06g/L、6的配方利于雨生红球藻虾青素的积累。
　　最后，在分子水平上对雨生红球藻氮代谢中的关键酶-硝酸还原酶进行了研究。首次克隆了雨生红球藻硝酸还原酶基因DNA及cDNA序列。硝酸还原酶基因序列的全长为5636bp，含15段外显子和14段内含子，cDNA序列的全长为共2718bp，共编码905个氨基酸，对雨生红球藻的硝酸还原酶氨基酸序列进行BlastP比对分析，发现有三个较为保守的结构域分别为Mo-Co复合体结合域、亚铁血红素结合域和FAD结合域。采用实时荧光定量PCR的方法对硝酸还原酶基因的转录水平进行分析，发现在培养基中硝酸钠的浓度为0-1.0g/L时，随着硝酸盐浓度的增高，雨生红球藻硝酸还原酶的表达量增加。这可能是由于硝酸还原酶是硝酸盐同化的关键酶，培养基中硝酸盐浓度增高，需要的硝酸还原酶增多，所以其表达量就会增加，进而使得雨生红球藻的生长速度加快。
　　综上所述，本研究采用紫外诱变的方法，诱变筛选了生长速度较快且虾青素含量较高的藻株，初步确定了其适宜的氮源和磷源浓度，为工业生产奠定了基础。通过克隆硝酸还原酶基因并分析其在不同氮浓度下的转录水平，为研究雨生红球藻的氮代谢过程及指导氮源优化提供了分子基础。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．虾青素的结构、功能及来源

1．1 虾青素的化学结构

1．2 虾青素的功能

1．3 虾青素的来源

2．雨生红球藻的生物学特性

3．雨生红球藻中虾青素的积累机制

4．影响雨生红球藻生长及虾青素积累的主要因素

4．1 光照对雨生红球藻生长及虾青素积累的影响

4．2 温度对雨生红球藻生长及虾青素积累的影响

4．3 pH对雨生红球藻生长及虾青素积累的影响

4．4 营养盐对雨生红球藻生长及虾青素积累的影响

5．微藻育种的方法

5．1 自然选择育种

5．2 诱变育种

5．3 生物学方法育种

5．4 雨生红球藻诱变育种的研究进展

6．硝酸还原酶研究进展

7．论文的立项依据和研究目的

第二章 雨生红球藻的诱变选育

1 材料与方法

1．1 藻种来源

1．2 培养基各营养成分及其制备

1．3 培养条件

1．4 实验方法

2 实验结果

2．1 雨生红球藻培养液吸光度-细胞密度关系的确定

2．2 虾青素含量测定时超声破碎时间的确定

2．3 诱变时间的确定

2．4 突变株的筛选

2．5 突变株的性状测定

3 讨论

第三章 雨生红球藻培养基氮源和磷源的优化

1．材料与方法

1．1 藻种

1．2 培养基

1．3 培养条件

1．4 实验方法

2．实验结果

2．1 硝酸钠对雨生红球藻生长和色素积累的影响

2．2 碳酸氢铵对雨生红球藻生长和色素积累的影响

2．3 氯化铵对雨生红球藻生长和色素积累的影响

2．4 不同磷浓度对藻株的影响

2．5 正交实验结果

3．讨论

第四章 藻株硝酸还原酶基因的克隆及其转录分析

1．材料与方法

1．1 藻种

1．2 培养基

1．3 培养条件

1．4 实验方法

2．结果分析

2．1 雨生红球藻基因组DNA的提取

2．2 硝酸还原酶基因的克隆

2．3 测序结果及序列分析

2．4 硝酸还原酶表达量分析

3．讨论

全文总结

参考文献

致谢

个人简历