盐胁迫下盐地碱蓬叶片V-H-ATPase H亚基的克隆与表达分析

摘要

盐分胁迫主要包括渗透胁迫及离子胁迫。渗透胁迫、离子胁迫及其造成的一系列次级胁迫如氧化胁迫等，严重干扰植物体内业已存在的细胞及整株水平上的水分及离子稳态，造成植物细胞分子损伤，生长减缓甚至死亡。因而植物对抗盐胁迫的一个重要策略是在高盐环境下重建体内的稳态(homeostasis)，包括重建离子稳态(ionichomeostasis)和渗透稳态(osmotichomeostasis)等。本实验以典型的积盐型盐生植物盐地碱蓬为材料，探讨了盐对盐地碱蓬V-H+-ATPaseH亚基基因及蛋白表达的影响，分析了V-H+-ATPase对液泡Na+区隔化的作用；构建了含有V-H+-ATPaseH亚基基因ssVHA-H的植物表达载体并转化拟南芥，分析了过量表达V-H+-ATPaseH亚基基因对拟南芥耐盐性的影响，主要实验结果如下： 1.NaCl胁迫对盐地碱蓬V-H+-ATPaseB、H、c亚基基因表达及V-H+-ATPase活性的影响Northern分析表明盐胁迫明显诱导了盐地碱蓬V-H+-ATPaseB、H、c亚基基因转录。400mmol/LNaCl处理盐地碱蓬植株0-120h发现盐胁迫明显诱导了盐地碱蓬V-H+-ATPaseH亚基基因表达;100、400mmol/LNaCl处理盐地碱蓬植株，分析其叶片V-H+-ATPase亚基基因表达也发现盐胁迫明显诱导了盐地碱蓬V-H+-ATPaseB、H、c亚基基因表达并且其表达量随盐处理浓度的增加而增大。V-H+-ATPaseB、H亚基位于H+-ATPaseV1区而c亚基位于H+-ATPaseV0区，三者基因表达均为盐胁迫所诱导，证明盐胁迫下盐地碱蓬V-H+-ATPaseB、H、c亚基基因表达存在协同作用。 用GST-SsVHA-H△4-206免疫家兔制备了盐地碱蓬液泡膜V-H+-ATPaseH亚基多克隆抗体。200mmol/LNaCl处理盐地碱蓬植株分离其叶片液泡膜微囊进行Western-blot分析发现盐胁迫明显诱导了盐地碱蓬V-H+-ATPaseB、H、c亚基蛋白的表达，证明盐胁迫下盐地碱蓬V-H+-ATPase各亚基在翻译水平存在协同表达。100、400mmol/LNaCl处理亦明显增加了盐地碱蓬叶片液泡膜微囊H+-ATPase活性，表明盐胁迫下，盐地碱蓬V-H+-ATPase各亚基在转录、翻译水平的协同表达增加了H+-ATPase全酶的数量，进而增大了H+-ATPase的活性。 2.过量表达盐地碱蓬液泡膜V-H+-ATPaseH亚基基因对拟南芥耐盐性的影响 过量表达盐地碱蓬V-H+-ATPaseH亚基基因的转基因型拟南芥植株比野生型具有较好的抗盐能力。在不含盐的MS培养基上，转基因植株的生长与野生型植株没有明显差异，说明外源基因的插入和过量表达并没有影响植物的正常生长。在含10mmol/LLiCl的MS培养基上，转基因植株叶色、生长明显好于野生型植株。在含15mmol/LLiCl的MS培养基上，野生型植株白化死亡而转基因植株仍正常生长。 而在含NaCl的MS培养基上野生型植株比转基因植株长势要好。在含125mmol/LNaCl的MS培养基上萌发并生长的野生型植株叶色明显好于转基因拟南芥植株；在含150mmol/LNaCl的MS培养基上，野生型和转基因植株的生长均明显受到抑制，但野生型植株的生长状况明显好于转基因型；将在MS培养基上生长四周的野生型、转基因拟南芥幼苗转移到含150mmol/LNaCl的MS培养基上，4天后观察其生长情况发现：盐影响了野生型植株的生长，使其叶片下卷；但转基因植株叶绿素遭受严重破坏，叶子白化，几近死亡。 总之，盐生植物盐地碱蓬的耐盐性与其液泡Na+区隔化有密切关系。盐胁迫促进了盐地碱蓬V-H+-ATPase基因的转录，酶蛋白含量的增加，进而增大了H+-ATPase的活性，为液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白提供了更多的质子驱动力，促进了Na+/H+逆向转运蛋白的活性，从而促成了液泡Na+区隔化，减小了Na+的毒害，使盐地碱蓬植株可在盐渍生境中完成生活史。过量表达盐地碱蓬SsVHA-H提高了转基因拟南芥植株的耐LiCl的能力，证实离子区隔化在植物抗盐方面的重要作用，为利用分子生物学手段进行作物耐盐新品种的培育奠定了基础。但在含NaCl的MS培养基上野生型植株比转基因植株长势较好。这些结果表明过量表达盐地碱蓬V-H+-ATPaseH亚基基因干扰了转基因拟南芥的抗渗透胁迫能力，而增强了其抗离子胁迫能力。其详细机制有待于进一步证实。 本实验主要创新点： 1.本实验成功制备了盐地碱蓬V-H+-ATPaseH亚基多克隆抗体。 2.本实验较为详细地研究了盐地碱蓬V-H+-ATPaseH亚基在盐胁迫下的表达变化，证明盐胁迫下盐地碱蓬V-H+-ATPaseB、H、c亚基表达在转录、翻译水平存在协同作用。 3.盐胁迫明显增加了盐地碱蓬叶片Na+含量，同时V-H+-ATPase的表达活性也增加，说明盐胁迫下盐地碱蓬V-H+-ATPase在液泡Na+区隔化中起到关键作用。 4.构建了含有V-H+-ATPaseH亚基基因的植物表达载体并转化拟南芥，筛选到10、15mmol/LLiCl胁迫环境下，转基因拟南芥植株生长发育均好于野生型，证明H亚基在V-H+-ATPase中起一定作用，进一步验证了液泡离子区隔化在植物耐盐方面的重要作用。但在含NaCl的MS培养基上野生型植株比转基因植株长势较好，可能是因为渗透胁迫的影响。

目录

文摘

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第一部分文献综述

第二部分实验论文

实验结果与分析

讨论

参考文献

附录

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致谢

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