维生素C抑制ERK1/2磷酸化上调collagenVI表达促进3T3-L1前脂肪细胞成脂分化

摘要

白色脂肪细胞嵌入由胶原蛋白（collagen）和蛋白聚糖组成的胞外基质（extracellular matrix，ECM）网络中。Collagen是构成间质纤维和细胞基底膜最丰富的蛋白。研究表明，collagen VI（Col VI）在动物白色前脂肪细胞成脂分化中逐渐增多，且在成熟脂肪细胞中表达量最高。胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）是丝裂原活化蛋白激酶家族成员，调控细胞增殖和分化。维生素C（vitmin C, VC）具有促进甘油三酯积累以及脂肪分解的双重作用，并参与胶原蛋白翻译后的羟基化修饰过程。 VC具有促进白色前脂肪细胞成脂分化的作用，但其调控机制依然未完全明了。基于前人研究成果及我们的前期实验结果，我们提出假设：VC通过减弱ERK1/2磷酸化，上调Col VI的表达，进而上调成脂相关分子的表达，最终促进动物白色前脂肪细胞成脂分化。本文探讨了VC衍生物L-抗坏血酸-2-磷酸（AA2P）促进3T3-L1小鼠前脂肪细胞成脂分化的分子机制，并验证上述假说。 1.实验分组 将3T3-L1前脂肪细胞分为6组。在开始诱导其成脂分化（D0）的同时，分别使用AA2P、ERK1/2磷酸化抑制剂（U0126）、总胶原蛋白合成抑制剂（EDHB）、Lenti-Col VI-GFP和EDHB+U0126处理，持续处理细胞14天。实验分组如下： 组1分别为完全培养基未诱导组和单纯AA2P处理组（N.I.和N.I.+AA2P）； 组2分别为成脂诱导组和成脂诱导+AA2P组（I和I+AA2P）； 组3分别为成脂诱导+U0126组和成脂诱导+U0126+AA2P组（I+U0126和I+U0126+AA2P）； 组4分别为成脂诱导+EDHB组和成脂诱导+EDHB+AA2P组（I+EDHB和I+EDHB+AA2P）； 组5分别为成脂诱导+慢病毒Col VI组和成脂诱导+慢病毒Col VI+AA2P组（I+Lenti-Col VI和I+Lenti-Col VI+AA2P）； 组6分别为成脂诱+U0126+EDHB组和成脂诱导+U1026+EDHB+AA2P组（I+EDHB+U0126和I+EDHB+U0126+AA2P）。 2.实验结果 （1）AA2P促进3T3-L1小鼠前脂肪细胞成脂分化 1）形态学变化特征：单独使用AA2P处理即可启动部分前脂肪细胞成脂分化，但其成脂分化率远低于经典诱导剂处理组（即单纯诱导组，组1，I组）。在添加经典诱导剂的基础上合用AA2P（组2，I+AA2P组），可明显促进前脂肪细胞成脂分化，其成脂分化率高于单纯诱导组，表明AA2P和经典诱导剂对前脂肪细胞成脂诱导作用是正向叠加的。 2）靶分子转录和翻译水平变化特征：在前脂肪细胞成脂分化的整个过程中AA2P可显著上调Col VI、SREBP-1c、PPARγ2和C/EBPα的mRNA以及蛋白表达，且在成脂分化早中期（D0-D7）延缓 C/EBPβ的下调；显著降低成脂分化早中期 ERK1/2的磷酸化水平（p-ERK1/2），但对总ERK1/2无影响。 （2）抑制ERK1/2磷酸化可阻滞前脂肪细胞成脂分化 1）形态学变化特征：在成脂分化早期（D0-D3）添加ERK1/2抑制剂U0126（100μM）才可完全阻断前脂肪细胞成脂分化进程；而AA2P可部分（15.2±5.4%）反转该抑制作用。 2）靶分子转录和翻译水平变化特征：U0126可显著降低前脂肪细胞成脂分化早中期ERK1/2磷酸化水平；在整个成脂分化过程中C/EBPβ、PPARγ2和C/EBPα的mRNA和蛋白表达显著下调，而Col VI mRNA和蛋白表达显著上调；在成脂分化晚期SREBP-1c mRNA和蛋白表达显著下调；AA2P处理后可部分上调成脂分化中晚期（D8-D14）SREBP-1c、C/EBPβ、PPARγ2和C/EBPα的mRNA和蛋白表达，同时进一步上调Col VI的表达；且完全阻断成脂分化早期ERK1/2磷酸化水平。 （3）阻断总胶原蛋白合成可抑制前脂肪细胞成脂分化 1）形态学变化特征：100μM的EDHB可完全抑制前脂肪细胞成脂分化。AA2P处理后可部分（50.6±4.8%）反转EDHB对前脂肪细胞成脂分化的抑制作用。 2）靶分子转录和翻译水平变化特征：在前脂肪细胞成脂分化的整个过程中 EDHB显著上调Col VI mRNA表达，而Col VI蛋白表达在成脂分化早期降低，中期增多，晚期再次降低；ERK1/2磷酸化水平与之相反；成脂细胞SREBP-1c、C/EBPβ、PPARγ2和C/EBPα的mRNA和蛋白表达水平显著下调；AA2P处理后显著上调成脂分化中晚期Col VI、SREBP-1c、C/EBPβ、PPARγ2和C/EBPα的mRNA和蛋白表达水平；显著降低成脂分化早期ERK1/2磷酸化水平。 （4）敲低Col VI抑制前脂肪细胞成脂分化 1）形态学变化特征：敲低Col VI可明显抑制前脂肪细胞成脂分化进程。AA2P处理后可部分（20.4±4.3%）反转该抑制作用。 2）靶分子转录和翻译水平变化特征：Col VI mRNA敲低率为65.3±0.5%，在整个成脂分化过程中SREBP-1c、C/EBPβ、PPARγ2和C/EBPα的mRNA和蛋白表达水平显著下调，而ERK1/2磷酸化水平在成脂分化早期（D3）显著增加。AA2P处理后部分上调了SREBP-1c、C/EBPβ、PPARγ2和C/EBPα的mRNA和蛋白表达水平，但表达量仍低于Col VI非敲低组；另外，成脂分化早期ERK1/2磷酸化水平显著降低。 （5）同时阻断ERK1/2磷酸化和总胶原蛋白合成可抑制前脂肪抑制细胞成脂分化 1）形态学变化特征：联合使用EDHB和U0126可完全抑制前脂肪细胞成脂分化。AA2P处理后仅可部分（10.5±3.2%）反转该抑制作用。 2）靶分子转录和翻译水平检变化特征：联合使用EDHB与U0126可显著降低ERK1/2磷酸化水平；在整个成脂分化过程中成脂细胞Col VI mRNA水平显著上调，而Col VI蛋白水平则显著下调；SREBP-1c、C/EBPβ、PPARγ2和C/EBPα的mRNA和蛋白水平显著下调。AA2P处理后，Col VI mRNA、SREBP-1c和C/EBPαmRNA和蛋白水平虽有所上调，但与U0126+EDHB处理组相比，无显著性差异；Col VI蛋白在成脂分化晚期有所增加；C/EBPβmRNA和蛋白水平在成脂分化早期显著上调；PPARγ2 mRNA和蛋白在成脂分化晚期显著上调；ERK1/2磷酸化水平在成脂分化早期进一步降低，至晚期时基本消失。 3.实验结论 （1）在不添加成脂诱导剂的条件下，AA2P单独使用即可启动部分3T3-L1前脂肪细胞成脂分化；与成脂诱导剂同时添加可最大化的促进前脂肪细胞成脂分化，表明AA2P与成脂诱导剂的作用是正向叠加的； （2）ERK1/2磷酸化抑制剂U0126可显著上调Col VI的表达，提示磷酸化激活后的ERK1/2可抑制Col VI的表达； （3）敲低Col VI可增加ERK1/2磷酸化水平，提示Col VI可抑制ERK1/2磷酸化； （4）AA2P可通过减弱成脂分化早期ERK1/2磷酸化，上调Col VI的表达，Col VI可进一步减弱ERK1/2的磷酸化，从而解除成脂分化早期ERK1/2磷酸化激活对PPARγ的磷酸化作用，间接增强其转录活性，促进3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化。

目录

声明

英文缩写词说明

第一部分 文献综述

1 脂肪组织与前脂肪细胞

2 VC与前脂肪细胞分化

3 胶原蛋白与前脂肪细胞成脂分化

4 ERK1/2信号通路与前脂肪细胞成脂分化

5 VC、ERK1/2信号通路与胶原蛋白

6 论文研究的目的及意义

第二部分 AA2P促进3T3-L1前脂肪细胞成脂分化

1 实验设计

2 实验材料与试剂

3 实验仪器

4 实验步骤

5 实验结果

6 讨论

7 小结

第三部分 ERK1/2磷酸化抑制剂抑制3T3-L1前脂肪细胞成脂分化

1 实验设计

2 实验材料与试剂

3 实验仪器

4 实验步骤

5 实验结果

6 讨论

7 小结

第四部分 总胶原蛋白合成抑制剂抑制3T3-L1前脂肪细胞成脂分化

1 实验设计

2 实验材料与试剂

3 实验仪器

4 实验步骤

5 实验结果

6 讨论

7 小结

第五部分 敲低Col VI抑制3T3-L1前脂肪细胞成脂分化

1 实验设计

2 实验材料和试剂

3 实验仪器

4 实验步骤

5 实验结果

6 讨论

7 小结

第六部分 EDHB与U0126合用抑制3T3-L1前脂肪细胞成脂分化

1 实验设计

2 实验材料与试剂

3 实验仪器

4 实验步骤

5 实验结果

6 讨论

7 小结

全文讨论与总结

参考文献

攻读博士期间发表的学术论文

致谢

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