花色苷与人血清蛋白、糖化血清蛋白相互作用研究

摘要

本文通过荧光光谱、傅里叶红外光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色谱以及分子对接等技术研究了C3G与HSA、gHSA的相互作用机制；对猝灭机理、结合能力、作用力类型、结合位点数以及作用位点等实验参数进行了分析。并进一步研究了C3G对HSA糖化的影响，对C3G的抗糖化能力进行了分析，进而对抗糖化作用阶段以及抗糖化方式等进行了推测。最后比较分析了 C3G，D3G 与P3G三种花色苷对HSA糖化的影响，对三种花色苷的抗糖化能力进行了比较，推测了可能影响花色苷抗糖化能力的相关因素。为花色苷对糖尿病的预防与防治提供了一定的理论支持。本论文主要分为以下部分： 1. 综述了花色苷的分类、结构以及部分生理功能。介绍了人血清蛋白的基本结构与糖化机理过程。对距今为止，有关花色苷和血清蛋白作用的研究的进展、方向进行了大体介绍。并进一步论述了相关研究技术在小分子与蛋白间相互作用方面上的应用。对本课题的选题目的、意义以及研究方面进行了描述。 2. 采用荧光、紫外、红外光谱、圆二色谱法、分子对接等分析技术分别研究了C3G与HSA、gHSA的相互作用。实验发现C3G与HSA，gHSA的结合机理为静态猝灭，主要作用力为氢键和范德华力。HSA，gHSA中的色氨酸、酪氨酸残基均受到了C3G影响，但C3G与HSA，gHSA的结合对氨基酸残基的微环境几乎没有影响。从二级结构方面来说，C3G 对二级结构影响较大，且糖化效应能够抑制C3G与血清蛋白的结合作用。通过pH依赖实验证明，pH对C3G 与血清蛋白的结合有较大的影响，且pH 7.4 时，结合能力最强，且蛋白结构发生了N-B转换。分子对接实验也在一定程度上证实了上述实验结果。 3. 运用透射电镜、圆二色谱、红外、原子力显微镜等技术研究了C3G对HSA糖化的影响，实验发现：在孵化期间 C3G 在缓冲液中的稳定性良好，其残留量足以与HSA发生结合作用。在孵化过程中，单纯HSA的粒度半径有一定程度的增加（约10 nm），然而其二级结构并没有发生明显的改变。与葡萄糖相比较，C3G 对 HSA 结构稳定性影响程度更大，且两者之间存在竞争结合关系。此外，实验发现C3G可以通过影响AGEs的形成有效地抑制HSA糖化的进行。并且通过对实验研究数据与相关研究的综合分析，我们推测 C3G的抑制效应主要存在于AGEs形成的第二与第三阶段之间，其可能通过三种不同的方式对AGEs的形成进行影响：抑制果糖胺的重排；诱捕活性羰基化合物以及抑制HSA分子间交联。实验进一步对C3G能够影响HSA交联的原因进行探究发现，C3G对于HSA二级结构与表面粗糙度的影响可能是其能够抑制交联发生的主要原因。 4. 借助紫外可见吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱以及原子力显微镜研究了C3G，D3G与P3G三种花色苷对HSA糖化的影响。实验表明，三种花色苷均能够通过影响果糖胺与AGEs的形成对HSA的糖化产生抑制。通过对三种花色苷的比较分析发现，三种花色苷对AGEs生成部位的极性具有不同程度程度的影响（D3G，29 nm>C3G，18 nm>P3G，2 nm）。与C3G相比，P3G与D3G使得HSA样品在280 nm处吸光度的增强（P3G>D3G>C3G）更为明显。花色苷能够有效地抑制由葡萄糖引起的HSA样品的荧光猝灭，且抑制强度为D3G>P3G>C3G。CD图谱显示，P3G与D3G对HSA二级结构的影响强于C3G对HSA的影响程度。原子力显微图谱显示，D3G，P3G并未对HSA表面形态起到保护作用，HSA样品的Rms 粗糙度与平均高度均有一定程度的减小。通过对实验数据的综合分析，我们推测影响花色苷抗HSA糖化作用的主要原因在于花色苷B环的差异性，即受到花色苷本身抗氧化性与极性的影响。通过DPPH法对花色苷抗氧化能力的测定也进一步间接支持了该推测。

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