血管紧张素转化酶2对于胶原及其限速亚单位P4Hα1的作用和机制研究

摘要

背景：
　　胶原是人体中细胞外基质（ECM）中主要的结构蛋白，其中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白是血管壁结构中最常见的胶原蛋白亚型，其分泌和降解的平衡是维持细胞外基质正常，增加动脉斑块稳定以及降低血管壁破裂的重要因素。
　　众所周知，4羟基-脯氨酸羟化酶（P4H）对于胶原蛋白的生物合成具有重要作用，它是一个具有两个α亚基和两个β亚基的四聚体，其中，α亚基决定其生物活性，足量的P4Hα1可以促进胶原蛋白的合成，而P4Hα1表达的降低也可相应减少胶原蛋白的含量。
　　在人体内，肾素-血管紧张素系统与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。其中，血管紧张素 Ⅱ（AngⅡ）可以引起血管收缩，血管平滑肌细胞增殖肥大以及诱导炎症反应的产生。有关研究已经证明 AngⅡ可以抑制P4Hα1的活性和降低胶原的合成以破坏 ECM的结构，从而导致斑块的不稳定和破裂。在肾素血管紧张素系统中的另一物质血管紧张素转化酶2（ACE2），具有与 AngⅡ的反作用，可发挥很强的抗炎症反应作用，并可促进胶原的合成以及斑块的稳定，而且可将 AngⅡ水解为血管紧张素（1-7）（Ang（1-7）），后者作为 AngⅡ的内源性拮抗因子，可与 AngⅡ产生对抗作用。
　　目的：
　　1.在体外实验中，观察 ACE2是否可以促进 P4Hα1的表达并增加胶原蛋白含量。
　　2.在体外实验中，研究并探讨 ACE2对于 P4Hα1以及胶原合成的作用机制和途径。
　　方法：
　　ACE2重组腺病毒的制备
　　通过 AdMax系统制备携带 ACE2的重组腺病毒（AdACE2）以及增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的重组腺病毒（AdEGFP）。
　　对细胞的预处理
　　用10-6mol/L的AngⅡ刺激平滑肌细胞24小时。24小时候再对细胞进行分组刺激。
　　对细胞的刺激
　　用106pfu AdEGFP刺激细胞24小时以及用相同剂量的AdACE2刺激细胞24,48,72小时来研究 ACE2对 P4Hα1的作用。为了研究 Ang（1-7）的作用，在时间效应实验中，用10-6mol/L的Ang(1-7)刺激细胞2,4,8,16,24小时；在剂量效应实验中，用10-5mol/L,10-6mol/L以及10-7mol/L的Ang(1-7)分别刺激细胞24小时。接下来，为了分析 ACE2的作用机制，用Ang(1-7)的抑制剂 A779来作对比，将实验分为六组，每组刺激24小时，除了ACE2为106pfu外，Ang(1-7)和A779都是10-6mol/L，具体分组为对照组，AdACE2组，AdACE2+A779组，Ang(1-7)组,Ang(1-7)+A779组和A779组。
　　实时定量 RT-PCR
　　细胞刺激结束后，提取细胞的RNA并进行逆转录，使用实时定量RT-PCR检测 P4Hα1的mRNA含量，并通过β-actin的CT值进行校准。
　　Western blot
　　提取经过刺激的细胞的蛋白质后，通过进行凝胶电泳，转膜，谈后标记一抗和二抗，进而曝光，最后可以观察到目的蛋白的表达。
　　ELISA
　　将细胞的上清液提取出来以后，使用ELISA试剂盒分析得出胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达含量。
　　结果：
　　ACE2促进 P4Hα1的表达
　　在时间效应实验中，用106pfu AdACE2分别刺激细胞24,48,72小时，通过 RT-PCR发现24小时后，P4Hα1的表达最强烈，明显高于其他各组，到48小时时表达已降低，72小时与48小时时差别不大，但都高于对照组以及AdEGFP组。
　　Ang(1-7)增加 P4Hα1的表达
　　对于 Ang(1-7)对 P4Hα1的作用效果，在时间效应实验中，用10-6mol/L的Ang(1-7)刺激细胞2,4,8,16,24小时，发现其效果随时间逐步上升并在24小时时达到最高且明显高于对照组；在剂量效应实验中，用10-5mol/L,10-6mol/L以及10-7mol/L的Ang(1-7)分别刺激细胞24小时，结果显示，其作用效果随浓度的上升而上升，在其后的实验中，选取10-6mol/L作为 Ang(1-7)的作用浓度。
　　A779抑制ACE2和Ang（1-7）对于 P4Hα1的作用
　　为了研究 ACE2对于 P4Hα1的作用机制，除了用AdACE2和Ang(1-7)刺激细胞外，还使用了Ang(1-7)的抑制剂 A779与两者混合刺激。根据 RT-PCR以及Western的结果，单纯 Ang(1-7)的刺激要比单纯 ACE2的刺激作用大的多，加入抑制剂后，A779可以几乎全部抑制Ang(1-7)的作用但是只是部分抑制了ACE2，单纯的A779刺激使得 P4Hα1表达比对照组更低。说明 ACE2对 P4Hα1的作用途径是通过对 AngⅡ的降解来提高 Ang(1-7)，而Ang(1-7)是直接产生促进作用。
　　ACE2提高胶原蛋白的含量
　　通过 ELISA分析，胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的含量在 ACE2和Ang(1-7)刺激下明显升高，且前者高于后者。A779加入后，ACE2的作用大约60％被抑制，而Ang(1-7)的作用基本上全部被抑制。
　　结论：
　　1.ACE2可以促进 P4Hα1的表达以及增加胶原蛋白的含量。
　　2.ACE2对于 P4Hα1和胶原的作用途径可以分为两部分，一方面水解AngⅡ,可减少其对 P4Hα1和胶原的抑制作用；另一方面通过水解 AngⅡ增加 Ang(1-7)的含量，提高 P4Hα1表达和胶原合成。

目录

中文摘要

英文摘要

目录

前 言

材料与方法

1.使用仪器

2.试剂

3.实验使用细胞：动脉粥样硬化病人的主动脉血管平滑肌细胞（ HASMC）

4.细胞培养

5.重组腺病毒质粒构建

6.腺病毒扩增

7.对细胞的转染与刺激

8.实时定量RT-PCR

9.Wstern blot

10.ELISA

结 果

1. ACE2对P4Hα1的促进作用

2. Ang(1-7)对P4Hα1的促进作用

3. Ang(1-7)受体阻滞剂A779对于ACE2以及Ang(1-7)作用的影响

讨 论

1.斑块与胶原代谢

2. AngII-ACE2-Ang(1-7)系统与胶原代谢

3. ACE2及其产物Ang(1-7)促进P4Hα1的量效关系

4. ACE2促进P4Hα1与胶原表达的途径

5.创新点与限制性

结 论

附 图

参考文献

综述：肾素血管紧张素系统与斑块稳定及胶原代谢的关系

1.背景

2.易损斑块与细胞外基质

3. 斑块的稳定性与胶原代谢

4. 肾素血管紧张素系统与胶原代谢

5. 今后研究方向

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文