三价抗真菌融合基因植物表达载体的构建及转基因烟草的抗病性分析

摘要

植物真菌病害一直是影响农作物产量,降低农作物品质的主要原因.在植物抗病基因工程中,通过将抗真菌蛋白基因导入植物来提高植物对真菌病害的抵抗能力已成为一种直接而有效的方法.随着越来越多的抗真菌蛋白被发现,人们试图采用多基因共表达的策略来将多种抗真菌蛋白基因转入植物,以提高植物的抗病能力和抗病谱.但是,由于受到目前可选择的载体数目和载体容量的限制,这个目的很难较好的实现.融合基因技术就是近几年出现的用于解决这一难题的有效途径.通过构建融合基因表达融合蛋白,可以实现多个基因的同步、同水平、同细胞定位表达.正是由于上述优点,融合基因技术正越来越受到人们的关注.该研究选择烟草Ⅰ类几丁质酶(CHI)、小麦硫堇蛋白(THI)和烟草Ⅰ类β-1,3-葡聚糖酶(GLU)三个已经证明是具有很强抗真菌病害能力的植物抗病蛋白,通过构建融合基因来实现三个蛋白在烟草体内的共表达,以求达到提高烟草对真菌病害的抵抗能力的目的.

目录

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英文缩写符号及中英文对照表

1引言

1.1获得多价转基因植物的策略

1.1.1多基因和多个表达载体构建策略

1.1.2基因转化策略

1.1.3问题与展望

1.2融合基因研究进展

1.2.1利用融合蛋白对目的基因进行示踪

1.2.2利用融合基因增强目的基因的表达

1.2.3利用融合蛋白改变目的蛋白的免疫原性

1.2.4相同或相似功能的基因融合

1.3植物抗真菌病害基因工程的策略

1.3.1在植物与病原识别水平上调控而激活植物的抗病机制

1.3.2导入植物防卫反应基因增强植物抗病性

1.3.3导入降解或抑制病原菌致病因子的基因使植物抗病

1.4几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因及其应用

1.4.1几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的特性和分类

1.4.2几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的应用

1.5硫堇蛋白

1.5.1硫堇蛋白的分类

1.5.2硫堇蛋白的合成过程

1.5.3硫堇蛋白的体外抗菌作用

1.5.4硫堇蛋白的异源表达

1.6MAR序列在防止基因沉默中的应用

1.6.1基因沉默现象

1.6.2使用MAR序列防止基因沉默

1.7本研究的目的及意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株与质粒

2.1.3生化试剂和其它材料来源

2.1.4计算机软件和网络数据库

2.1.5 PCR引物

2.2实验方法

2.2.1植物材料的种植

2.2.2目的基因的克隆

2.2.3表达载体的构建

2.2.4根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备及转化

2.2.5利用农杆菌介导转化烟草

2.2.6烟草再生植株的PCR检测

2.2.7烟草再生植株的Southern blot检测

2.2.8转基因植株的Northern blot检测

2.2.9转基因植物的Western blot检测

2.2.10转基因烟草蛋白提取液中CHI和GLU活性的测定

2.2.11转基因烟草的抗病检测

3结果与分析

3.1构建融合蛋白的可行性分析

3.1.1蛋白质的一级结构分析

3.1.2物理化学特性曲线预测

3.1.3二级结构预测、潜在的信号肽与断裂位点、转膜区分析

3.1.4三个蛋白的3-D结构建模分析及融合蛋白空间构象的预测

3.2 CHI、THI和GLU的克隆

3.2.1植物总RNA的提取及反转录

3.2.2 RT-PCR克隆目的基因

3.2.3目的基因的测序

3.2.4构建融合基因所需片段的克隆

3.3融合基因植物表达载体的构建

3.3.1融合基因的构建过程

3.3.2融合基因的PCR鉴定

3.3.3融合基因的测序

3.4融合基因植物表达载体的构建

3.5植物表达载体质粒转化农杆菌

3.6烟草再生植株的获得

3.7烟草再生植株的PCR检测

3.8转基因植株的Southern blot分析

3.9转基因烟草的Northern blot分析

3.10转基因烟草的Western blot分析

3.10.1抗体的制备

3.10.2融合蛋白FG1的细胞定位

3.10.3融合蛋白表达水平的检测

3.11融合蛋白中各组分蛋白的活性测定

3.12转基因烟草的抗病性分析

3.12.1体外抗菌试验

3.12.2植物体活体抗菌试验

4讨论

4.1表达融合蛋白中的问题

4.2植物抗病反应中抗真菌蛋白的协同效应

4.3抗病蛋白的细胞定位对其作用的影响

4.4 MARS序列增强基因表达的原理

4.5影响大肠杆菌中外源基因表达的因素

5结论

参考文献

致谢