鸡常见呼吸道病诊断基因芯片的研制与应用

摘要

本研究用分子克隆方法获得新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒与鸡毒支原体各一段高度保守基因片段作为探针，用芯片点样仪点样到硝酸纤维膜上，制备成检测基因芯片；提取样品中的RNA进行反转录和生物素标记后滴加到芯片上进行杂交反应，对杂交结果进行扫描分析，可同时对上述五种常见鸡呼吸道疾病做出诊断。本研究共分为以下三部分：第一部分针对靶基因的标记尝试了三种核酸标记方法(掺入法、光敏生物素标记法和末端标记法)，试验结果表明用biotin-16-dUTP掺入法进行标记，灵敏度好于光敏生物素标记，特异性好于末端标记。在42℃下对杂交的时间进行了选择，试验表明，最优的杂交时间为1h。第二部分基因芯片方法和病原分离培养法与PCR方法的比较对五种病的阳性病料各10份进行了对比检测，用基因芯片方法检测NDV、AIV、IBV、MG比分离方法检出率依次高20﹪，30﹪，30﹪，40﹪，与PCR方法检出率基本一致。分析表明，分离培养法和PCR与基因芯片方法相比差异极显著(p＜0.01)。同时对它们相互之间的符合率进行了比较，结果表明，基因芯片法与PCR法符合率在90﹪以上，而分离法和PCR、基因芯片法符合率相对较低。第三部分基因芯片的初步应用利用制备好的基因芯片在四家单位实验室进行了疑似呼吸道病病料的检测，并和PCR检测结果进行了比较，结果表明两者符合率基本在90﹪以上。

目录

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英文缩略表

引言

试验一鸡常见呼吸道疾病基因芯片诊断方法的建立

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1阳性克隆鉴定结果

2.2膜的选择

2.3有效性测定

2.4杂交条件的优化

2.5样品的标记

2.6芯片效能评价

2.7扫描结果

3讨论

3.1芯片的制备

3.2样品的标记

3.3杂交条件的优化

3.4芯片效能评价

3.5使用基因芯片注意事项

试验二三种诊断方法的比较研究

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1三种诊断方法的比较

2.2三种诊断方法符合率的比较

3讨论

试验三基因芯片的初步应用

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1临床应用对比检测结果

2.2匀浆液样本和棉拭子样本的比较

3讨论

结论

参考文献

附录

附图

致谢

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