硫丹降解菌的筛选、鉴定及降解机理研究

摘要

硫丹(Endosulfan)是一类广谱环戊二烯类杀虫剂，主要用于果树、蔬菜、谷物、棉花、树木及观赏植物的害虫防治，年使用量非常大。由于硫丹有效期长，对鱼类具有较大危害性，并对哺乳动物具有积累毒性，由此带来的环境污染问题也受到人们的普遍关注，因此利用微生物降解硫丹已成为近年来研究的热点问题之一。 本研究应用富集培养法，筛选分离到两株高效硫丹降解细菌，对硫丹降解菌在液体培养基以及土壤中的降解特性和降解机理进行研究：并对硫丹降解菌解毒性能及其降解酶的降解特性进行了研究。主要研究结果如下： 1.从农药厂的污水处理池活性污泥中筛选获得2株硫丹降解菌CS5和C7，通过形态学、生理生化和16S rDNA序列同源性分析，将其分别鉴定为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)、苍白杆菌属(Ochrobacterum sp.)；其16S rDNA基因序列在GenBank中的注册号分别EU266588、EU647578。 2.菌株CS5对硫丹的最大耐受浓度达550 mg/L，可用于进一步的降解性能的研究。在纯培养条件下，利用高效液相色谱(HPLC)法，分别测定了菌株在不同液体培养基中对硫丹的降解。在pH 7和30℃条件下，细菌CS5在无机盐培养基MM、含碳无机盐培养基NSM和含硫的无机盐培养基MSM中都能将50 mg/L的硫丹在8天内降解到80％以上；同时测定了硫丹作为碳源或硫源、以及不同接种量、温度、pH对菌株降解能力的影响。结果表明：以硫丹为唯一碳源或硫源、接种量15％～25％、温度25℃～35℃、pH 7～9、菌株的降解效果较好。 3.在接入菌株CS5的土壤样品中，经过30天的降解后α-硫丹和β-硫丹的降解率都分别达到了74.2％和73.5％以上。说明菌株CS5在土壤中对于加快硫丹的降解起到了显著作用，由此说明菌株CS5在被硫丹污染土壤修复中的应用潜力。 4.经高效液相色谱(HPLC)和薄层色谱(TLC)测定微生物对硫丹的代谢途径表明，硫丹二醇是最主要的降解产物，由此说明菌株CS5主要是通过水解的途径降解硫丹。 5.利用Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002进行的umu-test实验检测到了硫丹在降解后遗传毒性的降低。在8天的降解过程中，在三种培养基中硫丹的遗传毒性伴随着硫丹的降解都有显著的降低，8天后的R值都小于2，检测结果都为阴性：在无机盐培养基MM中R值从3.5下降到1.28：在含硫无机盐培养基NSM中R值从3.5下降到1.14；在含硫无机盐培养基MSM中R值从3.5下降到1.15，而在空白对照中R值几乎没有什么变化。在30天的土壤中的降解过程中，硫丹的遗传毒性也是显著降低的，最后在灭菌的和未灭菌的土壤中的检测结果都为阴性。 6.运用SDS-PAGE和Native-PAGE对诱导和非诱导条件下菌体的全细胞蛋白质电泳分析表明，硫丹降解酶在菌株CS5中可能为组成型表达。各菌株粗酶活性分析表明，粗酶液能将50 mg/L的硫丹快速降解：降解酶在pH 5.5～7.5和30℃～45℃活性较高，最适pH 7，降解酶最适温度为40℃；此粗酶液可用于农产品表面的农药残留的快速清除和解毒。

目录

论文说明：英文缩写词

声明

摘要

1 前言

1.1 农药的作用及其危害

1.2 农药残留的生物修复研究概况及进展

1.2.1 降解农药的微生物菌株的筛选

1.2.2 农药降解菌的获得途径与鉴定

1.2.3 农药微生物降解的代谢途径与降解基因

1.2.4 影响农药降解的因素

1.3 有机氯农药硫丹的生物降解研究进展

1.3.1 有机氯农药与环境污染

1.3.2 硫丹的结构、应用和毒性

1.3.3 分离硫丹降解菌的研究进展

1.3.4 硫丹降解纯培养物的筛选及其种类

1.3.5 硫丹的微生物代谢途径

1.3.6 硫丹的基因克隆及降解酶筛选研究

1.4 SOS／UMU试验及其应用

1.4.1 Umu概述

1.4.2 SOS反应

1.4.3 SOS／umu实验原理

1.4.4 遗传毒理学应用

1.5 本研究的目的意义

1.6 本研究的创新点

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验菌种

2.1.2 药品试剂

2.1.3 仪器设备

2.1.4 培养基

2.1.5 试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 降解菌的富集驯化与筛选分离

2.2.2 降解菌的菌种鉴定及系统发育分析

2.2.3 降解菌的生长特性和降解性能

2.2.4 硫丹残留和降解产物的遗传毒性检测

2.2.5 硫丹降解基因的定位与克隆

2.2.6 硫丹降解酶的特性研究

3 结果与分析

3.1 硫丹降解菌的分离与鉴定

3.1.1 分离菌株的形态学特征

3.1.2 菌株的部分生理生化反应

3.1.3 菌株的16S rDNA系统发育分析

3.2 菌株的生长特性及降解性能研究

3.2.1 硫丹降解菌最大耐受浓度

3.2.2 高效液相色谱法测定残留硫丹的浓度

3.2.3 菌株生长特性及对硫丹的降解特性

3.2.4 菌株CS5接种量对降解能力的影响

3.2.5 温度对菌株CS5降解能力的影响

3.2.6 pH对菌株CS5降解能力的影响

3.2.7 菌株CS5在土壤中的降解性能

3.2.8 降解中间产物的检测

3.3 硫丹残留和降解产物的遗传毒性检测

3.4 硫丹降解基因的定位与克隆

3.4.1 硫丹降解基因的定位

3.4.2 硫丹降解基因的克隆

3.5 硫丹降解酶的特性研究

3.5.1 降解酶的表达特性

3.5.2 粗酶液的降解性能

3.5.3 温度对酶促降解的影响

3.5.4 pH对酶促降解的影响

4 讨论

4.1 硫丹的降解微生物

4.2 硫丹的微生物降解及解毒

4.3 硫丹的微生物降解途径

4.4 硫丹降解基因的克隆

4.5 硫丹降解酶的分离纯化

4.6 下一步工作设想

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间完成论文