羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究

摘要

生命活动的代谢过程中不断产生各种活性氧自由基(ROS)，羟基自由基(·OH)，超氧自由基(O2·-)是其中具有代表性的两种自由基，它们与生物体的衰老及许多疾病的发生都有重要关系。 ·OH是一种氧化能力很强的自由基，能很容易地氧化各种有机物和无机物，氧化效率高，反应速率快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的活性氧，与机体的衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关。O2·-不仅自身具有毒性，而且可以经过一系列反应生成其它活性氧自由基，进一步对生物体产生损伤作用，且停留时间较长。 人体内总自由基中约95％以上属于活性氧自由基，因此活性氧自由基的研究对人体有着特殊的意义。通过对活性氧自由基的检测研究，可以帮助我们更好的解释疾病产生的原因，加强有效的预防措施，减少机体的伤害程度。另外在衡量保健食品的抗氧化能力和中草药抗氧化物质的筛选中具有重要的指导意义和理论价值。 活性氧自由基反应性强，存在时间短，不易进行直接测定。目前国内外已有较多间接测定·OH和O2·-的方法。本研究在全面了解这些方法的基础上，研究了利用荧光分析技术测定活性氧自由基的方法，因为此技术具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点。本文合成了两种新型荧光探针，同时对这两种探针进行了检测选择性的研究，探讨了部分抗氧化剂对活性氧自由基的清除作用。具体研究内容分为以下三点： (1)通过鸟苷与过氧化氢光解反应，形成荧光物质8-羟基鸟苷，分析8-羟基鸟苷在不同条件下存在的形式及不同存在形式与荧光强度的关系。探讨羟基自由基产生及其与鸟苷反应的条件，根据荧光强度与羟基自由基的量效关系，研究羟基自由基与鸟苷作用的分子机理，探讨茶叶提取液和大蒜提取液通过清除羟基自由基对鸟苷的保护作用。 (2)设计合成一种新的荧光探针试剂-2-(2'-吡啶亚胺甲基)苯酚，建立检测O2·-和SOD活性的荧光方法，研究测定方法的最佳条件，并用于大蒜、菠菜、木瓜中SOD活性的测定，并与邻苯三酚自氧化法测定出的SOD活性进行了比较。 (3)建立了一种以2-(2'-噻吩基)苯并噻唑啉为新型荧光探针测定O2·-和SOD活性的荧光分析方法，探讨了其它物质对体系的干扰影响及荧光探针的检测单一性，研究测定方法的灵敏度，精密度，本法成功应用于大蒜、洋葱等生物样品中SOD活性的测定。 本论文首次对羟基自由基与鸟苷作用分子机理的荧光分析做了相关研究，并合成了新型荧光探针，用于O2·-和SOD活性的测定，且2-(2'-噻吩基)苯并噻唑啉对O2·-的检测具有专一性，得到较为满意的结果，但是也存在一些不足之处，如鸟苷与过氧化氢光解反应体系中测定·OH的含量时灵敏度还不够高，还需进一步探讨。活性氧自由基的测定方法还未能很好的应用于动物体的检测，有待进一步完善。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

1引言

1.1活性氧自由基的性质

1.1.1羟基自由基的性质

1.1.2超氧阴离子自由基的性质

1.2活性氧自由基的产生

1.2.1羟基自由基的产生

1.2.2超氧化物自由基的产生

1.3活性氧自由基的检测方法

1.3.1羟基自由基的检测方法

1.3.2超氧阴离子自由基的检测方法

1.4活性氧自由基的危害与清除

1.5论文研究内容及意义

2材料与方法

2.1仪器与试剂

2.2实验方法

2.2.1羟基自由基与鸟苷作用分子机理的荧光分析研究

2.2.2 2-(2’-毗啶亚胺甲基)苯酚为探针测定O2·-和SOD活性的荧光光谱研究

2.2.3 2-(2’-噻吩基)苯并噻唑啉为探针荧光法测定O2·-和SOD活性

3结果与讨论

3.1羟基自由基与鸟苷作用分子机理的荧光分析研究

3.1.1荧光光谱

3.1.2实验条件的选择

3.1.3清除羟基自由基作用研究

3.2 2-(2’-吡啶亚胺甲基)苯酚为探针测定O2·-和SOD活性的荧光光谱研究

3.2.1测定原理

3.2.2荧光探针与O2·-反应前后的激发光谱与发射光谱

3.2.3酸度和缓冲用量的影响

3.2.4反应时间的影响

3.2.5反应温度的影响

3.2.6邻苯三酚浓度的影响

3.2.7荧光探针浓度的影响

3.2.8试剂加入顺序的影响

3.2.9有机溶剂的影响

3.2.10方法的重现性及干扰试验

3.2.11 O2·-清除率实验及植物SOD提取液清除实验

3.2.12 SOD活性的测定

3.3 2-(2’-噻吩基)苯并噻唑啉为探针荧光法测定O2·-和SOD活性

3.3.1 O2·-和2-(2’-噻吩基)苯并噻唑啉(TBT)反应的机理

3.3.2荧光探针与O2·-、·OH和H2O2反应前后的激发光谱与发射光谱

3.3.3 pH值和缓冲用量的影响

3.3.4.反应温度的影响

3.3.5反应时间的影响

3.3.6邻苯三酚浓度的影响

3.3.7荧光探针浓度的影响

3.3.8试剂加入顺序的影响

3.3.9有机溶剂的影响

3.3.10方法的重现性及干扰试验

3.3.11 O2·-清除率实验

3.3.12生物样品中SOD活性的测定

4结论

4.1羟基自由基与鸟苷作用分子机理的荧光分析研究

4.2 2-(2’-吡啶亚胺甲基)苯酚为探针测定O2·-和SOD活性的荧光光谱研究

4.3 2-(2’-噻吩基)苯并噻唑啉为探针荧光法测定O2·-和SOD活性

参考文献

致谢

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