结核分枝杆菌生物膜形成相关基因的筛选与鉴定

摘要

目的：通过菌落表型变化并结合生物膜生长缺陷筛选并鉴定可能与结核分枝杆菌生物膜形成相关基因。
　　方法：利用带有Himar1转座子的MycoMarT7转座子系统建立结核分枝杆菌H37Ra随机插入突变库;筛选细菌表面结构发生变化和生物膜形成有变化的突变菌株;运用T-A克隆法并结合抗性标记挽救法获得突变菌株的随机插入基因侧翼序列,使用通用引物M13F和M13R进行测序,将测序结果与结核分枝杆菌H37Ra全基因组序列进行比对,并分析判断从而鉴定转座子插入位点。并运用生物信息学方法分析预测突变基因的功能,进而鉴定出与菌落形态或者生物膜形成相关基因。
　　结果：成功构建库容量约为1×104结核分枝杆菌转座子随机插入突变文库。通过菌落形态变化及生物膜缺陷表型筛选出39株突变株,成功鉴定出插入位点的突变菌株有16株,涉及16个基因发生突变,与野生株相比,其中8株成膜能力未发生任何变化,在20~25d即可形成生物膜,而编号P7C8的突变株为生物膜完全缺陷株,细菌培养观察至7周时间,依然未见生物膜形成表型;其余7株均出现生物膜生长或成熟延迟情况,其中2株成膜时间为30d时在气液界面才出现薄膜样,5株在40d左右才开始在气液表面形成肉眼可见的薄膜层。运用生物信息学方法预测,16个发生突变的基因中5个与脂质代谢相关,4个与细胞壁合成相关、2个与中间代谢和呼吸作用相关、1个调节蛋白相关基因,1个毒力相关基因,1个PE/PPE家族基因,还有2个功能未知基因。结合生物膜形成缺陷分析,其中8个基因可能与H37Ra体外生物膜的形成相关。
　　结论：本研究以结核分枝杆菌H37Ra菌株为研究对象,成功构建库容量约为1×104结核分枝杆菌转座子随机插入突变文库。以菌落形态变化及生物膜缺陷表型为切入点,筛选获得生物膜生长受损突变株及可能与结核分枝杆菌生物膜形成相关的基因信息,为结核分枝杆菌生物膜形成相关基因的分离鉴定提供新方法,同时为研究其致病机制及生物膜形成调控机制提供候选基因,为后续深入开展生物膜形成机制研究奠定基础。

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前言

材料与方法

1 主要实验仪器

2 主要试剂

3 菌株

4载体

5 培养基及实验试剂的配置

6 引物

7 实验方法

结果

1 结核分枝杆菌随机突变库的构建

2 突变文库的建立及表型变化筛选

3 成膜突变株筛选

4 结晶紫染色结果

5 成膜突变株突变基因的鉴定

6 基因生物信息学分析

讨论

全文总结

参考文献

综述

致谢

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