黄瓜花叶病毒与番茄不孕病毒RNA重组机制的初步探讨

摘要

病毒起源和进化的历程预示着病毒未来的变异方向，病毒的进化往往产生致病性更强的新毒株，因此了解病毒变异进化的规律，有助于制定更有针对性的抗病毒策略，避免病毒病的大面积暴发流行。大多数植物病毒为 RNA 病毒，而 RNA 重组是 RNA 病毒进化的主要方式之一。RNA 重组的现象在越来越多的 RNA 病毒中得到证实，但重组机制尚不完全清楚。本研究以黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV）---两种同属 RNA基因组病毒为研究对象，通过体外转录获得 CMV RNA1、CMV RNA2及 TAV RNA3，组合成假重组病毒，分别接种克氏烟（N.Clevelandii）,通过检测重组发生情况及重组病毒的致病性，对植物病毒 RNA的重组机制进行了初步探讨，具体结果如下：
　　 （1）以带有 T7 启动子的病毒基因组 RNA的 cDNA 克隆载体 CMV RNA1，CMV RNA2T2B，CMV RNA2，CMV RNA2W2B和 TAV RNA3△163(A)为模板，体外转录获得病毒 RNA，将不同来源的 RNA1，RNA2和 RNA3 进行人工组合，获得 3种假重组体病毒 c2（C1C2 T3△163(A)），qt（C1C2T2BT3△163(A)）和qw（C1C2W2BT3△163(A)）。
　　 （2）将人工构建的假重组体 c2，qt，qw分别接种克氏烟，结果表明，c2（带有Q-CMV2b）没有侵染活性，qt（带有V-TAV2b）和 qw（带有WAⅡ-CMV2b）在克氏烟上都有侵染活性，qt的侵染症状比 qw 更为严重，而且 qt和 qw的侵染症状均重于Q-CMV，这表明不同来源 2b蛋白会影响假重组病毒的症状表现。
　　 （3）提取 3种假重组体侵染 14dpi,28dpi和 35dpi 时的系统发病叶片总 RNA，分别以 CMV和 TAV 特异性探针进行 Northern blot分析，结果显示，接种 35dpi 时 qt 在 CMV RNA3的位置出现一条新的 CMV 特异性条带，但位置在 CMV RNA3条带之上，RT-PCR及序列比对分析表明，人工假重组体 qt的 TAV RNA3 与 CMV RNA1之间发生了重组，表明 TAV2b能促进 RNA 重组的发生。此过程涉及多种不稳定重组中间体，且重组位点呈现多样化。
　　 （4）序列分析结果显示，重组位点总是分布在 TAV RNA3的 2109nt-2386nt的277
　　 nt的区间内，并且发生重组的 2条 RNA序列的重组位点附近有同源序列5′-AGGTC
　　 CGAAGACGTTAAACTAC-3′（box1），但是重组位点并不在同源序列内，而是位于其下游非同源区，显然 box1 并没有起到促进同源重组的作用。其中，最长的重组体的序列是在 TAV RNA3的末端，搭接 CMV RNA1的保守区 310nt。这种重组方式较为特别，可能是一种新的重组机制。所有的重组中间体的3′ 端都带有 Q-CMV RNA的高度保守 TLS序列，可能由于在病毒复制过程中，起复制作用的是 CMV 复制酶，而它对于 CMV 310nt的起始识别更有效，而这个高度保守区能协助复制酶找到编码阅读框下游的搭接位点，因而能更好的合成 RNA。
　　 （5）构建重组中间体病毒的克隆载体，体外转录，获得中间体假重组体病毒。分别侵染克氏烟，症状大概一致，均为斑驳，明脉，暗绿等，与 CMV 侵染症状类似。结合 RT-PCR分析，筛选出稳定存在的重组病毒 C1C2T2BT3 pRE-8。其RNA3序列与最长的中间体序列一致。推测可能是 TAV3 pRE-8的 3′ 端的高度保守区，增加了病毒 C1C2T2BT3 pRE-8的侵染活性，相对于其他重组中间体更具有竞争优势，因此稳定存活。侵染克氏烟转接四代后，提纯病毒，侵染不同种烟草，进行症状分析。发现 C1C2T2BT3 pRE-8 致使心叶烟（N.Glutinosa）顶端坏死，推测2b蛋白与寄主的互作促使了坏死的发生。其他烟草表现为不同程度的花叶或斑驳。

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1前言

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5结论

参考文献

致谢